心脑血管疾病是人类健康的威胁之一,高发病率、高致残率和高死亡率是其最大特征,不但对人类的健康有影响,还更严重的降低了生活质量。在环境和生活习惯持续改变的背景下,心脑血管疾病在我国的发病高居不下,同时呈现出年轻化的迹象,因此针对心脑血管疾病的预防和治疗是医学研究的热点之一,同样是药物研发的新切入点。血栓形成是心脑血管疾病最核心的病理过程,决定着心脑血管疾病的发展和预后,血栓形成是众多因子共同参与的复杂过程。因此做到对血栓的有效预防,就相当于防治了心脑血管病的发生,同时改善其预后。然而用于临床的此类药物却很有限,常用的有肝素和华法林,虽具有一定的临床疗效,但却存在着起效延迟、给药不方便、易出血、需要监测、易与食物药物相互作用等不足。所以努力研发一种方便、安全的抗凝药物是很有必要的。水蛭(Leech)是中药中活血化瘀的的代表药,具有破血、逐瘀、通经的功效,临床上常用于各种瘀滞不通所引起的疾病。水蛭素(hirudin,H)是水蛭的唾液腺提取物之一,是很强的天然凝血酶抑制剂,但也存在一些不足,例如分子量小、半衰期短;功能单一;易出血等,因此本研究组对其进行基因重组,首先在其基因中插入具有抗血小板功能的RGD序列,同时在其N端连接SA(链霉亲和素)序列,如此增大其分子量,延长其半衰期。本实验首先对p ET-44b-SA-H-RGD质粒进行扩增并测序,在确定质粒序列与理论序列完全正确后,IPTG诱导融合蛋白并纯化,SDS-PAGE和Western-blot结果表明:成功诱导SA-H-RGD融合蛋白并纯化,进一步使用BCA法检测纯化蛋白浓度,并对SA-H-RGD的抗凝血酶和抗血小板活性进行验证;另一方面对已经筛选出来的纤维蛋白适配子G81-2进行修饰,在其5’端连接生物素(biotin)。在SA与biotin间存在特异性结合的原理上,使得SA-H-RGD与生物素标记的G81-2适配子可成功偶联,如此新型、靶向、多功能的抗凝分子将推进血栓性疾病防治的进程,有望降低心脑血管病的发生率,改善其预后。目的:由血栓引起的心脑血管疾病的发病率逐年上升,在心脑血管病中占有越来越高的比例,因此防止血栓的形成是防治心脑血管疾病的关键所在。因此本研究选择天然凝血酶抑制剂水蛭素为研究目标,在确定质粒序列与理论序列完全一致后,IPTG优化诱导SA-H-RGD融合蛋白并纯化,并对其功能进行验证。同时对纤维蛋白适配子G81-2进行biotin标记,成功将其与SA-H-RGD偶联,为靶向于血栓的抗凝新药物研发奠定基础。方法:1.将含p ET-44b-SA-H-RGD质粒的甘油菌先加入在无抗的LB培养液中培养,继而加入在氨苄青霉素(ampicillin,Amp)和氯霉素的LB培养液中培养。2.使用SSCS法制备Rosetta-gami感受态细胞。3.使用质粒提取盒提取p ET-44b-SA-H-RGD质粒,进一步测序确定SA-H-RGD序列。用Bio Edit软件对比所测SA-H-RGD序列与理论序列。4.将p ET-44b-SA-H-RGD质粒转化入Rosetta-gami感受态细胞,第二天挑取单个菌落,过夜培养,次日,将菌液按1:50的比例接种于双抗LB培养液,待OD值在0.4~0.6之间时,加入IPTG诱导,设计不同的浓度梯度和时间梯度,浓度梯度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mmol/L,时间梯度分别为0、1、2、3、4、5、6h,从而选择最佳的诱导条件。5.超声裂解菌液,冰上操作,超5s停10s,总时间60min。6.His Gravi Trap柱纯化蛋白,在Binding buffer清洗柱子,再将超声后的上清加入His Gravi Trap柱子进行纯化,继续加入Binding buffer,最后用Elution buffer洗脱蛋白。7.SDS-PAGE电泳,先配好胶,上样,浓缩胶电压90V,分离胶电压120V。完成后考马斯蓝染色,Odddesy红外荧光扫结果。8.Western-blot,先将凝胶转膜,转膜后用丽春红染液染色,再用封闭液blocking buffer封闭1h,加入一抗(anti-H)4℃过夜,第二天,继续加入二抗放置摇床1h,完成后用Odyssey红外荧光扫膜。9.BCA法检测纯化蛋白的浓度,先计算工作液体积,再制备标准品,将待测样品蛋白按一定浓度稀释,最后将标准品和待测蛋白样品依次加入96孔板,用酶标仪检测。10.通过检测不同浓度SA-H-RGD加入血浆后的APTT、PT、TT值,验证融合蛋白的抗凝血酶活性。11.通过电阻法测定加入不同浓度SA-H-RGD后血小板的聚集率,验证融合蛋白的抗血小板活性。12.对纤维蛋白适配子G81-2进行biotin标记,并将其与SA-H-RGD进行偶联,用EMSA进行检测。结果:1.通过SSCS法成功获得Rosetta-gami感受态细胞。2.获得了大量p ET-44b-SA-H-RGD质粒。3.测序结果经Bio Edit软件比对与理论序列相一致。4.反复优化表达条件,摸索出诱导蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.9mmol/L,诱导5h。5.可溶性分析结果表明表达蛋白主要存在于上清中,提示诱导的SA-H-RGD为可溶性蛋白。6.SDS-PAGE电泳发现纯化的蛋白在72KD附近有蛋白条带,Western-blot检测蛋白能和特异的一抗结合,表明融合蛋白表达成功。7.BCA法定量结果显示,纯化的融合蛋白浓度为7.8mg/m L。8.在抗凝血实验中,加入SA-H-RGD,APTT、TT和PT值均有延长,且存在量效关系,随着SA-H-RGD浓度增大,APTT、TT和PT值延长越明显。9.在抗血小板实验中,加入SA-H-RGD,血小板聚集明显被抑制,且随着SA-H-RGD浓度的增大,血小板聚集抑制越明显,存在量效关系。10.EMSA结果表明,本实验所表达的蛋白与前期所筛选的纤维蛋白适配子G81-2有结合功能。结论:本研究成功表达了融合蛋白SA-H-RGD;后者具有抗凝血、抗血小板聚集的功能;同时发现SA-H-RGD具有结合生物素的活性,能与生物素标记的纤维蛋白适配子成功偶联,这为后续的靶向血栓的抗凝新药物研发奠定了良好基础。