ERK5/AP-1信号通路在联苯胺诱导膀胱上皮细胞间质转化的作用及姜黄素干预机制的研究

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背景与目的:泌尿系统常见肿瘤中,膀胱肿瘤位于首位。膀胱移行细胞癌在膀胱肿瘤细胞组织类型中占大部分。膀胱肿瘤具有发病率高、复发率高、侵袭性强等特性,而且其监测、诊断、治疗等相关费用昂贵,给患者及社会带来沉重的医疗负担。然而膀胱癌发生、发展的机制尚未完全阐明。膀胱癌的致病因素多种多样,联苯胺等芳香胺类化合物是诱发膀胱癌的重要因素之一,然而其致癌机制还有待进一步揭示。上皮间质转化是上皮来源肿瘤发生发展的重要过程。姜黄素是一种多酚类化合物,其具有广泛的抗炎、抗肿瘤等作用。本实验主要研究目的是探究联苯胺刺激对人正常膀胱上皮细胞发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,及ERK5信号通路在此过程中的调控作用,以及姜黄素在此过程中的干预作用。方法:将人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)细胞暴露含有在不同浓度的联苯胺的培养液中培养4天,使用MTT方法检测不同浓度的联苯胺对细胞活力的影响,继而选择对SV-HUC-1细胞无毒剂量的联苯胺处理细胞。倒置显微镜观察处理后SV-HUC-1细胞的形态变化;划痕实验观察联苯胺处理后细胞转移能力变化;使用transwell实验检测细胞侵袭能力变化;采用免疫印迹(Western blot)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测检测细胞上皮间质相关蛋白及RNA含量变化;采用免疫荧光技术检测联苯胺刺激后细胞形态及细胞内EMT标志物蛋白含量的变化;ERK5活性变化和AP-1活性变化使用western blot检测;然后使用ERK5的特异性抑制剂XMD8-92和姜黄素处理细胞,观察膀胱上皮细胞形态及分子水平变化。结果使用MTT实验筛选出低浓度联苯胺(0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM)及姜黄素(1μM)作为实验剂量。显微镜下观察低浓度联苯胺处理SV-HUC-1细胞4天后,细胞变得分散,细胞由圆形或椭圆形拉伸变成长梭形,一部分细胞出现伪足。划痕实验证实联苯胺处理SV-HUC-1细胞愈合能力增强。Transwell实验证明SV-HUC-1的侵袭能力在联苯胺处理后得到增强。联苯胺处理后细胞分子水平发生变化,表现为上皮标志物E-Cadherin、ZO-1的蛋白和m RNA表达随联苯胺浓度上升而上升,而间质标志物vimentin、N-Cadherind的蛋白及m RNA、基质金属蛋白2(MMP-2)、基质金属蛋白9(MMP-9)的蛋白表达量上升。联苯胺处理使磷酸化的ERK5(phosphorylated ERK5,p-ERK5)表达增加,同时,降低了总ERK5的表达量,表明联苯胺处理激活ERK5信号通路,AP-1通路中phosphorylated c-fos(p-c-fos)和phosphorylated c-jun(p-c-jun)表达明显升高。XMD8-92可以抑制ERK5、AP-1信号通路活性,并抑制了联苯胺引起的SV-HUC-1细胞上皮间质转化过程,具体表现是:联苯胺处理后的长梭形的细胞转变为圆形或椭圆形,细胞伪足减少或消失并且伴有细胞集中趋势,划痕实验证明信细胞转移能力下降,transwell实验证明细胞的侵袭能力减弱,Western Blotting和q RT-PCR结果表明经膀胱上皮细胞经过XMD8-92处理后E-cadherin、ZO-1表达升高,vimentin、N-cadherin表达降低。姜黄素与联苯胺同时处理SV-HUC-1细胞时,联苯胺诱导的EMT过程也被抑制,同时ERK5/AP-1通路的活性也被抑制。结论 联苯胺暴露可诱导人正常膀胱上皮细胞间质转化,ERK5/AP-1正向调控联苯胺诱导的膀胱上皮间质转化过程。姜黄素可抑制联苯胺诱导的膀胱上皮间质转化,且姜黄素可抑制ERK5/AP-1活性。这些研究表明ERK5在联苯胺引发膀胱癌的过程中有重要调控作用,姜黄素可以抑制联苯胺的致癌过程,可以发挥抑制肿瘤发生、进展的功效。
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