【摘 要】
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橘小实蝇是一种毁灭性果蔬害虫,为害世界上热带和亚热带地区250多种水果和蔬菜。昆虫不育技术（SIT）是通过大量释放不育雄虫来降低昆虫的繁殖能力,从而控制昆虫种群数量、甚至根除害虫的一种害虫防治技术,被认为是控制采采蝇等害虫的有效手段。随着现代生物技术如转基因、RNAi、CRISR Cas9等进步和成熟,最近,基于遗传改造的不育昆虫技术已经成为现实。对精子发育中相关基因和mi RNAs的功能鉴定将为
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橘小实蝇是一种毁灭性果蔬害虫,为害世界上热带和亚热带地区250多种水果和蔬菜。昆虫不育技术（SIT）是通过大量释放不育雄虫来降低昆虫的繁殖能力,从而控制昆虫种群数量、甚至根除害虫的一种害虫防治技术,被认为是控制采采蝇等害虫的有效手段。随着现代生物技术如转基因、RNAi、CRISR Cas9等进步和成熟,最近,基于遗传改造的不育昆虫技术已经成为现实。对精子发育中相关基因和mi RNAs的功能鉴定将为基于遗传改造的不育昆虫技术提供靶标。在本研究中,我们以橘小实蝇为研究对象,对精子发育中相关基因和mi RNAs进行了鉴定和分析其功能,筛选获得能有效降低雄虫繁殖能力的靶标基因TF gaga,orb2,tektin1和tssk1,并发现mi R-125-3p和mi R-276b-3p通过调控orb2基因的表达,影响精子发育,这些结果为建立不依赖辐射、基于遗传改造的害虫不育技术提供靶标基因和mi RNAs,并害虫防治提供新思路。主要研究结果如下:在本研究第一部分,我们选取八个和精子发育相关的基因TF gaga,parkin,orb2,netrin-A,netrin-B,tektin1,Ddx1和tssk1进行研究。q RT-PCR结果表明TF gaga,orb2,tektin1和tssk1基因在精巢中和其它部位是差异表达的。鉴于它们在精巢中的高表达,我们对这四个基因进行功能鉴定。四个基因的序列比对和系统进化树分析表明,这些基因在不同农业害虫中是保守的。选取长度的开放阅读框序列,从橘小实蝇雄虫精巢中克隆并合成ds RNA,。对橘小实蝇雄虫饲喂这四种基因ds RNA的干扰结果表明能够沉默四个靶标基因的表达,TF gaga,orb2,tektin1和tssk1干扰雄虫分别有64.92%,71.19%,64.49%和58.99%表现出不育性,并且都降低了雄虫繁殖能力。在本研究第二部分,我们对橘小实蝇雄虫mi RNAs在繁殖中的功能进行研究。基于在雄虫繁殖力中显著影响,我们选取orb2基因进行研究。利用生物信息学方法,我们对orb2基因3’UTR的所有靶标mi RNAs进行预测。6个mi RNAs let-7-5p,mi R-9c-3p,mi R-125-3p,mi R-210-5p,mi R-276b-3p,mi R-3931-3p和orb2基因3’UTR具有互补性。在HEK293T细胞中进行的双荧光素酶实验证实,mi R-125-3p和mi R-276b-3p能够靶标orb2基因3’UTR。q RT-PCR结果表明mi R-125-3p和mi R-276b-3p的表达水平和orb2表达水平是相反的。mi R-125-3p和mi R-276b-3p的表达水平相较于精巢在其它组织中高表达。对雄虫饲喂mi R-125-3p和mi R-276b-3p类似物能够显著降低orb2基因表达水平,而mi R-125-3p和mi R-276b-3p的表达水平显著增加。对雄虫饲喂mi R-125-3p和mi R-276b-3p类似物分别降低雄虫67%和69%的繁殖力,混合饲喂mi R-125-3p和mi R-276b-3p类似物降低雄虫83%繁殖力。橘小实蝇精子发育中相关基因功能分析表明TF gaga,orb2,tektin1和tssk1基因影响橘小实蝇雄虫精子发育,对雄虫繁殖力是必需的。另外,我们发现mi R-125-3p和mi R-276b-3p通过靶标orb2基因调控精子发育。orb2基因和mi R-125-3p、mi R-276b-3p的功能研究将有利于发展基于遗传改造的昆虫不育技术。
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