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研究背景及目的:常染色体显性多囊肾病（autosomal-dominant polycystic kidney disease,ADPKD）是最为常见的遗传性致死性肾脏囊肿性疾病,由PKD1和PKD2基因发生突变导致。PKD1编码多囊蛋白1（polycystin 1,PC1）;PKD2编码多囊蛋白2（polycystin 2,PC2）。PC1和PC2可定位于细胞的多种膜结构上,如:细胞顶端膜的初级纤毛,内质网高尔基体膜和细胞基底侧膜等,并对维持细胞膜正常生理功能至关重要。顶端基底细胞极性紊乱在ADPKD患者肾组织中十分常见,且与肾囊肿发生发展密切相关。顶端基底细胞极性的正常建立主要依赖于三种核心蛋白复合体:PAR复合体、Crumbs复合体和Scribble复合体。其中Scribble复合体包含Scribble、DLG和LGL等蛋白,在建立和维持细胞基底侧面极性方面发挥重要作用。Scribble蛋白的N端含有16个富含亮氨酸的重复片段（leucine-rich repeats,LRR）结构域,而在其C末端则含有4个PDZ（PSD95/DLG/ZO-1）结构域,这些结构域与Scribble蛋白生物学功能密切相关。研究表明,敲低斑马鱼scrib基因表达可导致其产生前肾囊肿表型,提示Scribble蛋白在调控肾囊肿形成方面具有重要作用,但其在ADPKD肾囊肿发生发展中的作用尚不明确。近期研究发现,Scribble可以通过活化Hippo通路上游LATS1/2激酶来影响YAP蛋白的磷酸化水平,从而调控YAP蛋白亚细胞定位。而在ADPKD患者肾组织中,Hippo通路活性受到抑制,降低了YAP蛋白的磷酸化水平,从而促使YAP蛋白由细胞质中转移到细胞核内。研究表明,YAP蛋白在细胞核内聚集与肿瘤进展相关,但也有研究指出,细胞质中YAP可通过调控Wnt/β-catenin通路来抑制肿瘤细胞增殖。因此,探究细胞质YAP和细胞核YAP在ADPKD肾囊肿形成中的作用具有重要意义。本研究拟探究Scribble和细胞质YAP在肾囊肿形成中的重要作用,并阐明Scribble通过调控YAP蛋白亚细胞定位来影响ADPKD肾囊肿发生发展的具体机制。研究方法:（1）利用蛋白免疫印迹、免疫荧光和RT-PCR技术,分别检测ADPKD斑马鱼模型（pkd2 morphants）和细胞模型(小鼠Pkd2-/-细胞系)中Scribble的表达及定位情况;通过显微注射技术探究Scribble蛋白及其不同结构域（Scribble-LRR和Scribble-PDZ）对pkd2 morphants前肾囊肿形成的调控作用。（2）利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼scrib突变体,观察突变体鱼是否存在多囊肾相关表型。（3）通过蛋白免疫印迹、免疫荧光和RT-PCR技术分别检测Hippo通路分子（pLATS1、LATS1、pYAP和YAP）在斑马鱼scrib突变体和敲低Scribble的人肾小管上皮细胞中的表达情况。（4）利用蛋白免疫印迹、免疫荧光和RT-PCR技术,分别检测pLATS1、LATS1、pYAP以及YAP在pkd2 morphants和Pkd2-/-细胞系中的表达及定位情况;构建Tg（Tolcdh17:yap-gfp）、Tg（Tolcdh17:yapS87A-gfp）和Tg（Tolcdh17:yapS87D-gfp）转基因鱼,观察不同类型YAP蛋白（YAP、YAPS87A和YAPS87D）在斑马鱼前肾管上皮细胞中的定位情况;在pkd2 morphants中显微注射过表达不同类型YAP蛋白,观察其对pkd2 morphants前肾囊肿形成的影响;给予pkd2 morphants Verteprofin药物干预,观察拮抗YAP蛋白进入细胞核后效应对pkd2 morphants前肾囊肿形成的影响。（5）构建斑马鱼lats1突变体和yap突变体,观察突变体鱼是否存在前肾囊肿表型。（6）在Pkd2-/-细胞系中过表达Scribble腺病毒,观察Scribble可否在ADPKD疾病背景下调控pLATS1、LATS1、pYAP和YAP蛋白表达;在HEK293T细胞中分别过表达Scribble、Scribble-LRR和Scribble-PDZ,明确Scribble是通过哪一结构域来调控YAP蛋白的细胞亚定位;利用morpholino技术构建scrib morphants,并在scrib morphants中过表达不同类型YAP蛋白（YAP、YAPS87A和YAPS87D）,观察其对scrib morphants前肾囊肿形成的影响。结果:（1）Scribble在pkd2 morphants和Pkd2-/-细胞中表达下调。（2）免疫荧光检查发现Scribble定位于斑马鱼前肾管上皮细胞的基底侧膜上,且Scribble可与PC2在细胞膜上共定位。（3）过表达Scribble和Scribble-PDZ可抑制pkd2 morphants前肾囊肿形成,而过表达Scribble-LRR不具有类似效应。（4）斑马鱼scrib突变体具有前肾管增粗表型,而敲除scrib可促使pkd2 morphants前肾囊肿表型加重。（5）pLATS1和pYAP水平在scrib突变体和敲低Scribble的人肾小管上皮细胞中表达下调,且免疫荧光染色发现YAP蛋白在scrib突变体前肾管上皮细胞中由细胞质中转移到细胞核内。（6）pLATS1和pYAP水平在pkd2 morphants和Pkd2-/-细胞中表达下调;免疫荧光检测发现,在pkd2 morphants前肾管上皮细胞和Pkd2-/-细胞中,细胞质中YAP蛋白减少,细胞核内YAP增多。（7）免疫荧光染色发现,YAP和YAPS87D蛋白定位于转基因鱼前肾管上皮细胞的细胞质中,而YAPS87A定位于细胞核内。（8）过表达YAP和YAPS87D可抑制pkd2 morphants前肾囊肿形成,而过表达YAPS87A不具有类似效应;当给予pkd2 morphants Verteprofin药物处理时,其多囊肾相关表型不能得到有效缓解。（9）斑马鱼lats1突变体不具有多囊肾相关表型,但敲除lats1可促使pkd2 morphants前肾囊肿表型加重。（10）斑马鱼yap突变体具有前肾囊肿表型;过表达YAP和YAPS87D可抑制yap突变体前肾囊肿形成,而过表达YAPS87A不具有类似效应。（11）在Pkd2-/-细胞中过表达Scribble可有效提升pLATS1和pYAP表达水平。（12）过表达Scribble和Scribble-PDZ可提升pYAP表达水平,促使YAP蛋白从细胞核内转移到细胞质中,而过表达Scribble-LRR不具有类似效应。（13）scrib morphants具有前肾囊肿表型;过表达YAP和YAPS87D可抑制scrib morphants前肾囊肿形成,而过表达YAPS87A可促进scrib morphants前肾囊肿形成。结论:（1）Scribble和细胞质YAP在ADPKD肾囊肿发生发展中发挥重要调控作用;（2）Scribble和细胞质YAP对斑马鱼前肾管发育以及前肾囊肿形成至关重要;（3）Scribble可通过调控YAP蛋白亚细胞定位来影响ADPKD肾囊肿的发生发展。