论文部分内容阅读
哈维氏弧菌是海水养殖动物的主要病原菌,可引起鱼类眼球突出、体表出血、肌肉溃烂等症状且死亡率极高。随着抗生素在养殖动物中的大量应用,哈维氏弧菌对抗生素的耐药性也日益严重,特别是多重耐药菌株和超级细菌的出现,已经引起了全世界相关学者的高度关注。细菌质粒常带有耐药基因,可在同种属或异种属之间进行转移,这种水平转移常导致细菌耐药性的改变,从而造成细菌耐药基因的广泛传播。本文首先开展了采自中国华南沿海地区41株哈维氏弧菌对40种常见抗生素的耐药性研究,结果表明,41株菌均对阿米卡星耐药,40种抗生素对菌株的耐药率为4.9%～100%,所有菌株对40种抗生素的多重耐药比率在27.5%～95.0%之间,对30种以上抗生素耐药的菌株有15株。耐药谱型为41种,耐药谱的聚类分析得出,当欧式距离平方为2时,全部菌株聚类为7个类群(ⅰ～ⅶ)。当欧式距离平方为8时,全部菌株聚类为2个组群(Ⅰ、Ⅱ),组群Ⅰ菌株的耐药种类多于组群Ⅱ菌株,并且耐药谱型更多。因此,华南地区海水养殖水域中的哈维氏弧菌分离株耐药谱型多样,且具有严重的多重耐药性,来源不同的菌株耐药谱型存在差异。在所有调查菌株中,有36株菌携带质粒,检出率为87.80%,每个菌株携带1～5个质粒,从36株受试菌中共检出23种大小不同的质粒,分别为1.72～36.23 kb,形成20种质粒图谱。经EcoRⅠ消化后,所有菌株仍形成20种酶切质粒图谱,但谱型明显不同,表明这些菌株中存在大小相同但序列不一的质粒。本文采用变温法消除质粒。当通过37℃ (加入SDS)和43℃交替作用30代时,试验21株细菌的质粒全部被消除,但还有15株细菌质粒未被完全消除。根据ERIC分型结果,GDH11385类(华南地区哈维氏弧菌病原的主要遗传型)菌株携带的质粒可完全消除,而其他9种类型的菌株质粒均是部分消除。表明GDH11385类菌株的质粒易消除,对GDH11385进行质粒测序得出,携带的3个质粒容易在菌株间发生结合转移,从而使该菌在环境中具有竞争优势,也证明了该类型菌株具有较强的环境竞争优势,从而表现为该地区主要的弧菌病害病原菌。质粒消除后,有31株细菌的氨基糖苷类、β-内酰胺类、磺胺类、氟喹诺酮类共4大类抗生素的耐药性明显减弱。根据上述4大类药物的耐药基因(ant(3")-I、aac(6’)-I、blaTEM、blaCTX-M、FloR、Sul I、qnrVC、qnrA,2个/类药)设计了引物并对基因组作PCR检测,结果表明,阳性检出率分别是78%、63.4%、19.5%、46.3%、68.3%、70.7%、0、48.8%。根据菌株耐药表性和PCR检测结果可知华南沿海哈维氏弧菌的耐药基因具有多态性,以上常用的耐药基因不适合该地区菌株的耐药性检测。菌株耐药性与质粒图谱的相关性分析结果表明,HNH1105和HNH1111耐药表型明显不同但质粒谱相同,说明这两株菌的抗药性主要是由染色体基因编码的。WC13DH51和GDH11388的耐药表型和质粒谱均不相同,说明这两株菌的抗药性主要是由质粒基因编码的。耐药表型差异明显的菌株其质粒图谱可以相同也可以不相同,表明耐药谱和质粒图谱两者之间不存在明显的相互关系。综上所述,哈维氏弧菌的抗药性既可由质粒基因编码,也可由染色体基因编码。总之,本研究确定了华南地区41株哈维氏弧菌的抗药性特征和质粒图谱,并通过相关性分析,确定了抗生素的耐药基因在菌体中携带方式,不仅为华南地区因哈维氏弧菌引发的重大流行病的防控提供用药指导,还为阐明哈维氏弧耐药分子机制奠定了重要理论基础,意义重大。