【摘 要】
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[目 的]脊髓损伤后难以修复,本研究拟探讨Netrin-1及其受体DCC对原代脊髓神经元损伤的修复作用及机制,进一步验证神经元损伤后的修复与NgR-RhoA-ROCK信号通路的调控关系,为脊髓损伤修复提供新的治疗靶标。[方 法]1.构建脊髓损伤的细胞模型。采用CCK-8比色法,在细胞培养板中加入不同梯度浓度的L-谷氨酸（Glu）,检测各组细胞活力,确定PC12细胞及原代脊髓神经元损伤模型的最佳浓度
【基金项目】
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云南省科技厅-昆明医科大学,应用基础研究联合专项重点项目,2019FE001（-162）；
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[目 的]脊髓损伤后难以修复,本研究拟探讨Netrin-1及其受体DCC对原代脊髓神经元损伤的修复作用及机制,进一步验证神经元损伤后的修复与NgR-RhoA-ROCK信号通路的调控关系,为脊髓损伤修复提供新的治疗靶标。[方 法]1.构建脊髓损伤的细胞模型。采用CCK-8比色法,在细胞培养板中加入不同梯度浓度的L-谷氨酸（Glu）,检测各组细胞活力,确定PC12细胞及原代脊髓神经元损伤模型的最佳浓度。2.分别构建Netrin-1和DCC的过表达及低表达腺病毒,以及各自相应的对照。将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与不携带腺病毒基因组的包装质粒共转染HEK293细胞,通过Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组,产生重组腺病毒。感染进PC12细胞及原代脊髓神经元细胞验证腺病毒是否感染成功。3.体外实验分14组:正常组、Glu损伤组、Netrin-1过表达组、Netrin-1过表达对照组、Netrin-1低表达组、Netrin-1低表达对照组、DCC过表达组、DCC过表达对照组、DCC低表达组、DCC低表达对照组、Netrin-1和DCC共同过表达组、Netrin-1和DCC共同过表达对照组、Netrin-1和DCC共同低表达组、Netrin-1和DCC共同低表达对照组。4.在原代脊髓神经元细胞上按照分组感染Netrin-1、DCC腺病毒。5.通过免疫荧光检测各组神经元标记物（NeuN）及细胞核标记物（DAPI）的表达,Tunel染色检测神经元凋亡。6.使用qRT-PCR及WB的方法检测原代脊髓神经元细胞中Netrin-1、DCC、NgR、RhoA、ROCK1、ROCK2 的表达。7.划痕实验检测Netrin-1和DCC共同过表达组及共同低表达组的原代脊髓神经元细胞的迁移率。[结 果]1.成功构建脊髓损伤的细胞模型:CCK-8比色法筛选出PC12细胞中最合适的Glu损伤浓度为28 mmol/L,原代脊髓神经元细胞中最合适的Glu损伤浓度为200μmol/L。2.成功构建四种腺病毒:Netrin-1过/低表达腺病毒及DCC过/低表达腺病毒,并在PC12细胞及脊髓神经元中感染成功。3.通过免疫荧光染色Neun及CCK-8检测结果显示,Netrin-1低表达组及DCC低表达组Neun 阳性比率下降,神经元胞体萎缩,细胞活力下降;而netrin-1过表达组及DCC过表达组Neun阳性比率升高,神经元胞体面积变大,细胞活力上升。4.Tunel染色检测细胞凋亡结果显示,netrin-1低表达组和DCC低表达组细胞凋亡严重,而netrin-1过表达组和DCC过表达组细胞凋亡不明显。5.利用qRT-PCR检测各组神经元内NgR、RhoA、ROCK1、ROCK2的表达。结果显示,Netrin-1过表达组、DCC过表达组和Netrin-1/DCC共同过表达组与NgR、RhoA、ROCK1、ROCK2均呈负相关关系。6.WB检测各组神经元内NgR、RhoA、ROCK1、ROCK2的表达结果显示与qRT-PCR结果趋势相同。7.在原代脊髓神经元中的划痕实验结果显示,Netrin-1和DCC共同过表达组迁移率明显增加,Netrin-1和DCC共同低表达组的的迁移率明显减弱。[结 论]在Glu诱导的脊髓神经元损伤模型中,Netrin-1和其受体DCC结合后对恢复损伤后的原代脊髓神经元的正常细胞数量,神经元胞体面积、迁移率、细胞活力及凋亡至关重要。这种恢复与其在脊髓神经元中抑制NgR-RhoA-ROCK信号通路有关,它们在脊髓损伤后发挥保护神经元及寻路致靶中起关键作用。该研究结果将为未来治疗SCI提供新的思路。
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