2-酮基-L-古龙酸（2-keto-L-gulonic acid,2-KLG）是发酵法生产维生素C的直接前体。山梨糖脱氢酶（Sorbose dehydrogenase,SDH）是实现一菌一步发酵生产维生素C的关键节点之一。在前期研究中,本实验获得了一个来源于原始菌株氧化葡萄酸杆菌（Gluconobacter oxydans）WSH-004的FAD依赖的山梨糖脱氢酶,可以在不同的表达体系中实现活性表达。由于该山梨糖脱氢酶活性较低,如果需要利用其进行一菌一步发酵生产2-KLG,需要对其酶活进行大幅提升。本实验将来源于G.oxydans WSH-004的山梨糖脱氢酶在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行异源表达,发现该酶在E.coli中可以直接发酵催化L-山梨糖生成2-KLG。通过优化启动子、表达宿主筛选、优化发酵温度、敲除醛酮还原酶基因、敲除磷酸转移酶系统（Phosphotransferase system,PTS）中的相关酶基因和通过易错PCR对山梨糖脱氢酶进行随机突变等方法,从而构建一个适合研究山梨糖脱氢酶的高通量筛选平台。研究结果对代谢工程改造微生物实现一菌一步发酵生产2-KLG提供重要参考价值。论文主要研究结果如下:（1）基于代谢工程改造,本实验主要研究了E.coli中影响山梨糖脱氢酶活性的因素,及其对2-KLG产量造成的影响。首先,通过在E.coli中筛选与优化适用于表达山梨糖脱氢酶的条件,并确定了表达宿主E.coli BL21（DE3）、表达的启动子PcspA和发酵温度为37oC,以10g·L^-1的L-山梨糖作为底物,发酵结束时2-KLG产量达到2.83 g·L^-1。通过基因敲除发现在E.coli中醛酮还原酶会对2-KLG的产量造成影响,通过增加底物浓度为20 g·L^-1并优化培养方法使得2-KLG产量最高达到8.31 g·L^-1。并确定了磷酸转移酶系统中对L-山梨糖到2-KLG这条代谢途径产生影响的两个关键酶PtsI和PtsH。基于上述实验结果,初步建立了适合表达山梨糖脱氢酶的E.coli筛选平台。（2）通过全自动高通量微生物液滴培养（Microbial microdroplet culture system,MMC）,提高出发菌株对高浓度L-山梨糖的耐受性。通过在MMC中进行高浓度L-山梨糖的适应性培养,不断增加L-山梨糖的浓度,最终获得了两株能够耐受高浓度L-山梨糖的进化菌株1^-18和2-F6。并且在进化菌株中单独过表达SDH发酵48h时,10 g·L^-1L-山梨糖、20 g·L^-1L-山梨糖和30 g·L^-1 L-山梨糖培养基中2-KLG的产量分别为2.43 g·L^-1、4.11 g·L^-1、4.42 g·L^-1。而在进化菌株中共表达SDH/SNDH发酵48 h时,10 g·L^-1L-山梨糖、20 g·L^-1L-山梨糖和30 g·L^-1L-山梨糖培养基中2-KLG的产量分别为5.10 g·L^-1、5.40 g·L^-1、6.05 g·L^-1。（3）结合易错PCR和高通量筛选技术定向进化山梨糖脱氢酶,提高在E.coli中山梨糖脱氢酶催化L-山梨糖生成2-KLG的产量。基于前期建立的山梨糖脱氢酶筛选平台进行研究,经两轮易错PCR和高通量筛选,从1.3×104个突变体中筛选获得了一株正向突变株,底物浓度10 g·L^-1,2-KLG产量达到5.92 g·L^-1,比对照提高了14.1%。此外,在有益突变体中发现了一株突变体,该突变体第316位氨基酸突变为终止密码子,把山梨糖脱氢酶分成了两个模块进行表达。在此基础上,对原始山梨糖脱氢酶进行深入研究发现,该山梨糖脱氢酶分成两部分后,在山梨酮脱氢酶（Sorbosone dehydrogenase,SNDH）的帮助下能够催化L-山梨糖生成2-KLG。