研究目的研究Wnt3a对大鼠海马神经干细胞增殖、分化的作用。研究方法1.胎鼠海马神经干细胞的分离、培养、分化及鉴定：采用机械分离、无血清选择性连续传代培养法从孕14天SD大鼠胚胎海马组织中获得神经干细胞（neural stemcells，NSCs）。运用荧光免疫细胞化学染色的方法检测NSCs特异性标志物巢蛋白（Nestin）以及胞膜蛋白Wnt3a受体(卷曲蛋白, Fzd3)的表达情况，并进一步对NSCs的多向分化潜能进行鉴定。2. Wnt3a影响神经干细胞增殖的体外研究：取培养4天的神经干细胞，依据培养液的不同将其分为对照组、bFGF组、Wnt3a组及bFGF+Wnt3a组，观察记录四组细胞的生长情况。细胞培养7天后使用Brdu标记处于分裂增殖期的神经干细胞，并以之作为评估NSCs增殖程度的指标，用于后续的统计学分析。3. Wnt3a影响神经干细胞分化的体外研究：依据细胞培养液中是否添加Wnt3a分别设立Wnt3a组和对照组，对其培养14天后诱导分化。使用荧光免疫细胞化学染色法计算出对照组和Wnt3a组中NSCs向神经元及星形胶质细胞分化的比例，并以之作为评估NSCs分化趋势的指标，用于后续的统计学分析。研究结果1.神经干细胞的分离、培养、分化及鉴定：采用机械分离从孕14天SD大鼠胚胎大脑海马组织中获取的神经干细胞，经无血清培养基选择性连续传代培养能够大量增殖。荧光免疫细胞化学染色法证实我们培养的神经干细胞能够表达特异性标志物Nestin蛋白以及胞膜蛋白Wnt3a受体Fzd3，并具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。2. Wnt3a影响神经干细胞增殖的体外研究：四组NSCs培养7天后均呈抱团样悬浮性生长，在倒置相差显微镜下对比观察四组细胞形态学变化，结果发现对照组NSCs克隆球数目和体积较其余三组明显减少，而bFGF组克隆球体积较Wnt3a组增大，但两组间克隆球数目未见明显差异。bFGF+Wnt3a组克隆球数目较其余三组明显增多，而体积和bFGF组相比未见明显差异。使用Brdu对上述四组细胞进行标记，结果发现各组细胞Brdu阳性率分别为：14.8%、27.2%、38.6%、54.5%，四组细胞间两两比较的差异均有统计学意义（P<0.05）。3. Wnt3a影响神经干细胞分化的体外研究：两组细胞诱导分化24h后可见部分NSCs发出细小突起，随着分化时间的延长，胞体增大、突起数目逐渐增多。7天后细胞分化趋于稳定，对其进行GFAP、β-Tubulin-Ⅲ荧光免疫化学染色鉴定，结果发现对照组、Wnt3a组GFAP阳性率分别为68.42％±5.54％、56.20％±4.82％，而β-Tubulin-Ⅲ阳性率分别为8.54％±0.48％、11.25％±0.62％，对照组和Wnt3a组间GFAP、β-Tubulin-Ⅲ阳性率差异均具有统计学意义（P<0.05）。研究结论1.从孕14天SD大鼠胚胎海马组织中获得的神经干细胞，具有自我更新能力，可分化为神经元及星形胶质细胞。2.在体外培养条件下Wnt3a能够提高神经干细胞的增殖能力。3．体外环境下Wnt3a具有促进神经干细胞向神经元分化，并对星形胶质细胞的分化有抑制作用。