研究背景和目的肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,全球每年超过1百万人因肺癌失去生命。尽管在肺癌的治疗研究中投入巨大,但在过去几十年里,肺癌的治疗有效率和生存期的提高却很缓慢。这提示研究者尚有重要的未知机制在影响肺癌的发生发展以及治疗。在肿瘤治疗过程肿瘤细胞受到颇多关注,机体免疫系统引起的肿瘤免疫应答反应和免疫监视作用却往往受到忽视。临床研究发现许多类型肿瘤组织内有淋巴细胞浸润,说明了肿瘤抗原介导并刺激了机体的肿瘤免疫原性。机体免疫系统与肿瘤之间的复杂关系一直困惑着于研究者,部分研究提示肿瘤浸润淋巴细胞可作为一种肿瘤愈后良好的标志,但也有部分学者对此提出了质疑。由于每个病人自身的免疫机能差别巨大,临床研究难以找到良好的对照样本,因此有必要寻找一种合适的动物模型来研究机体免疫机制与肿瘤的关系。肿瘤动物模型一直是研究肿瘤发生发展机制的重要工具之一,但由于小鼠与人体固有的基因及免疫系统的差异,在一定程度上限制了人类疾病在小鼠体内模型的研究。因此,建立一种具有类似人体免疫环境的实验动物模型显得尤为重要。人源化小鼠是将人外周血单个核细胞通过外周血液循环或腹腔输注入小鼠体内构建的人鼠嵌合体模型。人源化鼠模型小鼠来源最常选用联合免疫缺陷(SCID)小鼠和非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠品系。在上述品系小鼠体内可重构人体内的免疫系统,较好地模拟人体液环境及细胞免疫功能。人源化鼠解决了长期以来动物模型不能确切反映人体免疫系统的特点及研究人体免疫应答仅限于体外实验的难题。活体成像技术是利用活体生物发光或荧光成像直接检测活细胞在动物体内的生物学行为,目前已成为广泛应用于医学、生物学及药物开发等研究领域的前沿技术。近年研究者利用绿色荧光蛋白(GFP)标记目标肿瘤细胞,利用活体荧光成像系统在荷瘤动物模型上以直观图像的方式,获得肿瘤生长及转移的信息,并能早期观察到肿瘤治疗效果。我们在前期的研究中构建了一株肺腺癌耐药细胞系Am1010,来源于一位女肺癌病人的上臂肌肉转移灶。病人在这个肌肉转移灶出现前接受了4周期化疗,放疗及靶向治疗。这株Am1010细胞表现出了对多种化疗药物、放射治疗和靶向药物易瑞沙的抵抗能力和体内侵袭基质和血管的能力。前期实验通过慢病毒载体已构建稳定表达GFP的Am1010细胞株,在GFP标记Am1010后示踪的普通SCID鼠体内,这些具有不同生长粘附能力的Am1010子代亚细胞系亦表现出显著不同的侵袭基质和血管的能力。那么,在模拟人体免疫环境的人源化小鼠体内,这些具有治疗抵抗的Am1010细胞又将如何表现呢?本研究通过构建人源化鼠模型结合动物活体成像系统来观察绿色荧光标记的肺癌耐药细胞系Am1010在人源化小鼠体内侵袭及转移情况,并进一步探讨肿瘤体内侵袭及转移与机体免疫系统的关系。方法1.异位肺癌模型组20只NOD/SCID小鼠随机分为2组：人源化组(A组)10只,非人源化组(B组)10只；5只NOD/SCID小鼠为非荷瘤人源化组(C组)。原位肺癌模型组20只NOD/SCID小鼠随机分为2组：人源化组(D组)10只,非人源化组(E组)10只。2.将0.2ml 4×108/ml Am1010-GFP细胞悬液皮下种植于一只NOD/SCID小鼠背部皮下,待皮下移植瘤形成时采用外科手术方法将瘤块取出,并剪成1×3x3mm碎片。异位肺癌模型组每只小鼠左侧肋翼皮下塞入一块瘤块碎片,构建小鼠异位肺癌模型(n=20)。通过右侧胸腔内注射方法分别将0.1ml5×108/mlAm1010-GFP细胞悬液种植于原位肺癌模型组小鼠体内,构建小鼠原位肺癌模型(n=20)。3.A组小鼠种瘤当天与C组小鼠一起腹腔内接种0.2 ml/只(5×108/m1)人PBMC悬液构建人源化小鼠模型；D组小鼠胸腔内接种肿瘤细胞一周后,采用上述相同方式构建人源化原位荷瘤小鼠模型。采用流式细胞仪、免疫组化及wesyern blot方法检测免疫重构后小鼠外周血中人T淋巴细胞的表达量及T细胞亚群的比例和小鼠脾脏、肝脏、肺脏组织中人T淋巴细胞亚群CD3+T、CD4+T、CD8+T及Foxp3+Treg的表达情况。4.异位肺癌模型组小鼠接种肿瘤后每周(连续4周)进行活体荧光成像检测皮下肿瘤生长情况；原位肺癌模型组小鼠处死前行活体荧光成像检测肺内肿瘤原发灶及肿瘤转移情况。5.异位肺癌模型组及原位肺癌模型组小鼠肿瘤组织采用HE染色方法观察肿瘤内淋巴浸润情况,并进一步采用免疫组化及wesyern blot方法检测人T淋巴细胞亚群CD3+T、CD4+T、CD8+T及Foxp3+Treg的表达情况。6.统计学方法：所有实验数据应用SPSS13.0软件进行分析,统计学数据用均数士标准差(x±S)表示,采用t检验及重复测量方差分析。结果1.腹腔注射接种人PBMC 1周后,A组、C组所有小鼠外周血中即能检测出人CD3+T细胞,且CD3+T细胞占外周血所有有核细胞比例超过1%,免疫重建成功率100%。随后3周的监测中,人的CD3+T细胞占小鼠外周血中所有有核细胞比例逐步上升。重复测量统计分析显示不同时间点CD3+T细胞变化有统计学差异(F=855.026,P=0.000),组间CD3+T细胞表达量差异无显著性(F=0.165,P=0.692),CD3+T细胞表达量与时间之间无交互作用(F=0.139,P=0.745),提示随观察时间的延长,两组CD3+T细胞表达量变化趋势相同。A、C两组小鼠接种PBMC4周后外周血中人CD3+T细胞占小鼠外周血所有有核细胞比例和C组小鼠外周血人T淋巴细胞亚群CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值可达到人外周血淋巴细胞比例正常范围。重复测量统计分析显示不同时间点CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值变化有统计学差异(F=8.382,P=0.000),组间比值差异有显著性(F=99.624,P=0.000), CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值与时间之间有交互作用(F=6.528,P=0.001),提示随观察时间的延长,两组CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值变化趋势不相同。A组小鼠外周血中人CD4+T数量第2周开始下降,CD8+T细胞数量增多,CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值出现倒置和下降趋势。2.免疫重构4周后,免疫组化检测A组与C组小鼠脾脏大量表达人CD3+T细胞,A组与C组小鼠脾脏内CD3+T的表达量差异无显著性(t=0.373,P=0.715)。通过Western Blot方法检测免疫重建后小鼠的脾脏、肝脏、肺脏内有大量人CD3蛋白表达。免疫重构的两组小鼠脾脏中均表达人CD4+T细胞、CD8+T细胞和Foxp3, A、C两组中人CD4+T细胞、CD8+T细胞及Foxp3表达差异均有显著性(CD4t=8.382, P<0.01; CD8t=10.919, P<0.01; Foxp3 t=2.569, P=0.023),A组脾脏CD8+T细胞表达量高于C组,A组脾脏CD4+T细胞和Foxp3表达量低于C组。3.A、B组两组小鼠皮下移植AM1010-GFP瘤块成瘤率为100%。两组小鼠皮下肿瘤体积经重复测量统计分析显示不同时间点肿瘤体积变化有统计学差异(F=304.600,P=0.000),两组肿瘤体积与时间之间存在交互作用(F=99.271,P=0.000),提示随观察时间的延长,两组肿瘤体积变化趋势不同,B组肿瘤体积增长较快。进一步对各时间点两组肿瘤体积行t检验分析显示接种瘤块1周后两组肿瘤体积大小无差异；接种瘤块第2周,B组肿瘤体积与A组比较有统计学差异(t=2.252,P=0.043),B组瘤块体积较大；接种瘤块观察的最后2周,B组肿瘤体积显著大于与A组(P<0.01)。A组中有5只小鼠出现移植物抗宿主反应,其中1只在重建免疫系统后第26天死亡,C组中右3只小鼠出现该症状。B组中有2只小鼠因肿瘤耗竭严重,在接种瘤块后23天及25天死亡。A、B两组体重数据行重复测量统计分析提示不同时间点小鼠体重差异有显著性(F=206.212,P=0.000),组间体重差异无显著性(F=0.307,P=0.588),两组小鼠体重与时间之间无交互作用(F=1.556,P=0.204),提示随观察时间增加,两组体重变化趋势相同。4.异位肺癌小鼠模型两组NOD/SCID小鼠皮下接种AM1010-GFP瘤块一周后经活体成像仪检测,绿色荧光蛋白稳定表达,肿瘤荧光发光明显。经重复测量统计分析显示不同时间点小鼠皮下瘤块荧光面积与平均光密度值变化有显著差异(Area F=300.630, P=0.000; Photons F=327.810, P=0.000),两组瘤块荧光面积与平均光密度值与时间之间存在交互作用(Area F=92.226, P=0.000; Photons F=19.817, P=0.001),提示随观察时间的增加,两组瘤块荧光面积与平均光密度值变化趋势不同,B组瘤块荧光面积与平均光密度值增加明显。对各时间点两组肿瘤体积行t检验分析显示移植瘤块一周时A、B两组皮下瘤块荧光面积及平均光密度值无差异。接种瘤块第2周开始,B组皮下瘤块荧光面积大与A组(t=2.149,P=0.045),B组瘤块平均光密度值强于A组(t=2.185,P=0.042)。随后2周检测,两组瘤块荧光面积及平均光密度值差异更显著。5.A组小鼠肿瘤组织内可发现大量淋巴细胞浸润,在B组的肿瘤组织内未见明显淋巴细胞浸润。进一步对肿瘤组织进行T细胞亚群抗原标记染色检测发现,人源化小鼠皮下肿瘤组织中有大量人CD3+T、CD8+T淋巴细胞浸润,也存在少量CD4+T淋巴细胞浸润但未见Foxp3+Treg表达。 Western blot检测提示A、C两组小鼠脾脏、肝脏及肺组织内均表达人T细胞蛋白；A组与C组比较,小鼠脾脏、肝脏及肺组织内CD3蛋白含量类似,CD8蛋白表达量高,而CD4和Foxp3蛋白表达量较低。A组小鼠皮下肿瘤组织中高表达CD3、CD8蛋白,CD4及Foxp3表达量相对较少；B组小鼠各脏器及肿瘤组织内均未见人T淋巴细胞蛋白表达。6.腹腔注射人PBMC1周后检测D组小鼠免疫重建率100%,随后3周的监测中,人CD3+T细胞占小鼠外周血中所有有核细胞比例逐步上升,而CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值比出现倒置和下降趋势。免疫组化检测免疫重构4周后脾脏大量表达人CD3+T细胞。7.原位肺癌小鼠模型两组胸腔内种瘤小鼠全部存活。对两组小鼠体重数据行重复测量统计分析,提示不同时间点小鼠体重差异有显著性(F=580.095,P=0.000),组间体重差异有显著性(F=4.768,P=0.048),两组小鼠体重与时间之间存在交互作用(F=25.868,P=0.000),提示随观察时间增加,两组体重变化趋势不同。在第10天左右,两组小鼠体重开始出现下降趋势,但E组小鼠体重下降更快。D组小鼠中6只小鼠出现移植物抗宿主反应,其中1只小鼠在免疫重构第3周死亡；E组小鼠有4只小鼠因肿瘤耗竭死亡。8.通过活体成像系统观察到D、E两组小鼠右侧胸腔内均有原发灶生成,原位肺癌成瘤率100%。D组小鼠胸腔内转移率40%(4/10)；E组小鼠胸腔内转移率100%(10/10)。通过荧光活体成像分析,转移灶位于原发灶同侧其他肺叶、纵膈组织、膈肌、胸壁或对侧肺组织、膈肌。两组小鼠胸腔内肿瘤原发灶及转移灶荧光面积相比有统计学差异(Primary t=2.745. P=0.013, Metastasis t=9.691, P<0.01),D组原发灶及转移灶荧光面积小于E组；两组小鼠胸腔内肿瘤原发灶及转移灶荧光平均光密度值相比有统计学差异(Primary t=2.560, P=0.020, Metastasis t=3.068, P=0.008),D组原发灶及转移灶荧光平均光密度值低于E组。两组腹部及颅脑脏器经过活体荧光检测,均未发现转移灶。9.D组小鼠肺肿瘤组织内可发现大量肿瘤淋巴细胞浸润,在E组的肿瘤组织内却未见明显淋巴细胞浸润。免疫组化及western blot进一步人检测T细胞亚群检测提示CD3+、CD8+T高表达于D组小鼠肺肿瘤组织内,而CD4+T表达较少；而Foxp3+Tregs仅能通过western blot蛋白检测到微量表达。结论：1.通过往NOD/SCID小鼠腹腔内注射人外周单个核细胞方法可建立人源化小鼠模型。2.利用肺癌耐药细胞系Am1010在NOD/SCID小鼠体内可以构建皮下异位肺癌模型和原位肺癌模型。3.通过对人源化荷瘤小鼠外周血、脏器及肿瘤组织内T淋巴细胞亚群的检测说明我们在小鼠体内重构的人免疫系统有较强的细胞免疫应答能力,能明显抑制肿瘤侵袭和转移过程。4.人源化小鼠的肺癌转移模型有望成为探讨机体免疫系统与肺癌侵袭转移相互作用的一种新的研究工具。本研究创新之处1.利用中国南方人肺癌细胞系种子库一株肺癌耐药细胞Am1010在NOD/SCID小鼠体内构建皮下异位及原位肺癌模型。2.采用人源化鼠模型体内研究方式来探讨机体免疫系统与肺癌细胞Am1010侵袭及转移之间的关系。