研究背景Graves病(Graves’ disease,GD)是由遗传、免疫与环境因素共同作用的器官特异性自身免疫性疾病,以神经、循环、消化等系统兴奋性增高和代谢亢进为主要表现,是引起甲状腺功能亢进症最主要的病因,其发病机制至今尚未明了。GD患者体内免疫功能异常,产生了针对促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor,TSHR)的抗体即促甲状腺激素受体抗体(thyrotropin receptor antibody,TRAb),TRAb是一组多克隆抗体,分为兴奋型的甲状腺刺激抗体(thyroid stimulating antibody,TSAb)和封闭型的甲状腺阻断性抗体(thyroid blocking antibody,TBAb),TSAb是GD的主要自身抗体,几乎所有GD病例中都存在TSAb,而且疾病的严重程度与TSAb水平有关。TSAb与TSH竞争性地结合TSHR,并具有TSH类似的生物学功能,启动细胞内的级联反应,刺激和兴奋甲状腺,使甲状腺组织增生,这种刺激作用不受垂体TSH调节,失控的持续刺激致使甲状腺病理性地合成与分泌过量的甲状腺激素。TSHR作为自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid diseases,AITD)的特异基因在GD易感基因中是独特的,TSHR是第一个被检测到与GD相关的非主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因,这反映了 TSHR在GD发病机制中的重要性。TSHR所编码的蛋白不仅与GD的临床表现有关,也是GD自身免疫反应的直接靶点。因此,TSHR基因一直处于研究的焦点。TSHR基因位于14号染色体q31上,由10个外显子组成,编码一个G蛋白偶联受体,该受体在调节甲状腺生长、发育和功能方面发挥着核心作用。在过去十几年中,由于测量技术的发展使得在大量个体中检测数百个标记物的遗传变异得以实现,大大促进了常见遗传变异与复杂疾病之间的联系。全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)技术应用于大规模病例对照研究,使与疾病相关的易感基因的发现和单核苷酸变异的识别成为可能。GWAS的发展进一步建立起易感基因与GD之间强有力的关联。GD的易感基因除了TSHR和甲状腺球蛋白这些特异的甲状腺基因外还有一类为免疫调节基因,如叉头翼状螺旋转录因子(forkhead winged helix transcription factor p3,Foxp3),CD25,CD40,细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4),FC受体样基因 3 FC receptor-like 3(FCRL3),人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)等。FOXP3和CD25在建立外周耐受中起到重要作用,而CD40、CTLA-4和HLA基因在T淋巴细胞活化和抗原表达中起关键作用。FCRL3编码免疫球蛋白受体超家族成员,在T细胞、B细胞及NK细胞等免疫细胞均有表达,参与调节免疫,在自身免疫疾病的发病中发挥作用。这些免疫调节基因的多态性,对GD的易感性有重要影响。免疫调节基因中的单核苷酸多态性可能在功能上阻碍中枢和外周耐受的正常发育,并改变免疫突触中T细胞与抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APCs)的相互作用。因此,研究基因多态性对阐明GD的发生与发展以及临床表型的差异,易感与耐受,药物治疗的敏感性和预后及指导个体化治疗等方面具有重要意义。本研究首次在皖北汉族人群中对近年来GWAS发现的TSHR、CTLA-4、FCRL3三种GD易感基因位点在较大规模人群中进行联合检测,并对TSHR基因内含子1上和CTLA-4上易感位点及FCRL3易感位点与GD进行关联分析。这些易感位点可能在疾病发病中发挥重要的作用,探讨TSHR、CTLA-4及FCRL3单核苷酸多态性与Graves病的相关性为揭示GD的发病机制及未来进一步开展易感基因功能学研究提供理论基础。研究目的1.探讨TSHR内含子 1 区段的rs179247,rs2284722,rs12101261,rs4903964,rs2300525和rs1 7111394六个SNP位点与GD易感性的相关性2.探讨CTLA-4基因rs231804,rs1024161,rs231726和rs10197319四个SNP位点与GD易感性的相关性3.探讨FCRL3基因rs3761959 SNP与GD易感性的相关性4.分析各易感基因位点的假阳性报告率和三种基因间的交互作用研究方法以皖北地区汉族人群为研究对象,采用病例对照研究,GD病例组597例和正常对照组620例,蚌埠医学院第一附属医院内分泌科门诊收集相关临床资料,所有研究对象签署知情同意书,采集外周静脉全血,提取DNA,在Fluidigm EP1平台上应用Taqman探针分别对TSHR内含子1区段的六个SNP位点、CTLA-4基因四个SNP位点以及FCRL3基因rs3761959位点进行基因分型,分析各基因型与等位基因在两组中的分布,各位点单核苷酸多态性与GD易感性的关联分析,以及连锁不平衡和基因单体型与GD的关联分析,并对相关易感位点计算假阳性报告率以及分析各位点基因型与病例组临床表现的关系。统计学分析:定量资料描述采用x±s,定性资料描述采用百分率或构成比;t检验和卡方检验分别比较定量资料与定性资料的组间差异;二分类单因素和多因素logistic回归模型分析各SNP位点病例组和对照组中基因型与等位基因分布及各SNPs与GD的关系,计算OR值及95%置信区间评估各位点基因型与GD发病间的关系;等级资料采用秩和检验,卡方检验分析各位点基因型与GD临床表现的关系,以上统计学分析均运用SPSS 19.0软件完成;应用Haploview4.2软件对基因的SNP位点在对照人群中的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡进行检验,并对各位点组成的单体型与GD的关系进行分析;基因-基因之间的交互作用采用广义多因子降维模型(Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR)进行分析。所有检验均为检验水准α=0.05的双侧检验,P<0.05则差异有统计学意义。结果:1.在对照组人群中,TSHR内含子1区段的六个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。对于rs179247,rs2284722,rs12101261,rs4903964和rs17111394位点,相应的等位基因或基因型在两组间的分布,差异有统计学意义(P<0.05)。六个SNP位点与GD的关联分析,结果显示:rs179247等位基因G、rs12101261等位基因C、rs4903964等位基因G在全人群、男性人群及女性人群中与GD的发病呈负相关关系;rs179247G等位基因携带者患GD的风险分别是A等位基因携带者的0.57,0.56,0.57倍;rs12101261C等位基因携带者患GD的风险分别是T等位基因携带者的0.58,0.58,0.58倍;rs4903964G等位基因携带者患GD的风险分别是A等位基因携带者的0.58,0.60,0.58倍。rs2284722等位基因A与rs17111394等位基因C在全人群及女性人群中与GD的发病呈正相关关系,rs 2284722A等位基因携带者患GD的风险分别是G等位基因携带者的1.34,1.47倍;rs17111394C等位基因携带者患GD的风险分别是T等位基因携带者的1.29,1.37倍。rs2300525等位基因C仅在女性人群中与GD的发病呈正相关关系,C等位基因携带者患GD的风险是T等位基因携带者的1.25倍。rs179247,rs2284722,rs12101261 和rs4903964构成的单体型中单体型AGTA、AATA 与GD的发病风险呈正相关关系(OR=1.27,95%CI=1.07-1.50,P=0.005;OR=1.45,95%CI=1.21-1.75,P<0.001);单体型GGCG、GACG与GD的发病风险呈负相关关系(OR=0.56,95%CI=0.46-0.67,P<0.001;OR=0.40,95%CI=0.18-0.92,P=0.031)。rs2300525和rs17111394构成的单体型CC与GD的发病风险呈正相关关系(OR=1.32,95%CI=1.08-1.60,P=0.006)。TSHR各基因位点基因型与GD甲状腺肿、突眼及TRAb间相关性无统计学意义(P均>0.05)。2.在对照组人群中,CTLA-4基因四个SNP位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律(P>0.05)。rs231804,rs1024161 和 rs10197319 位点的等位基因或基因型在两组间的分布没有差异(P>0.05);rs231726位点的基因型在两组间的分布没有差异(P>0.05)。rs231726位点等位基因在病例组和对照组的分布差异有统计学意义(X2=4.47,P=0.035)。rs231726等位基因G在全人群中与GD的发病风险呈负相关关系,G等位基因携带者患GD的风险是A等位基因携带者的0.83倍。未发现rs231804、rs1024161位点与GD发病风险之间相关。rs231804,rs1024161和rs231726构成的四种单体型中AAA与GD的发病风险呈正相关关系(OR=1.21,95%CI=1.02-1.43,P=0.029),其他单体型均未发现与GD的发病风险相关。CTLA-4各基因位点基因型与GD甲状腺肿、突眼及TRAb间相关性无统计学意义(P均>0.05)。3.FCRL3 rs3761959位点各基因型在对照组及病例组的分布差异无统计学意义(χ2=0.278,P=0.598);两组等位基因差异无统计学意义(χ2=0.187,P=0.666);FCRL3 rs3761959位点SNPs与GD的关联分析结果显示在全人群、男性人群及女性人群中,显性模型、隐性模型、杂合模型及纯合模型均未发现rs3761959位点SNPs与GD发病风险之间存在相关关系(P均>0.05);4.易感基因rs179247、rs12101261、rs4903964假阳性报告率均小于预设临界值0.2。GDMR软件分析TSHR基因与CTLA-4基因及FCRL3基因间的交互作用,交叉验证一致性最佳者仅为单因素模型中rs179247模型,其训练平衡精度为0.59,测试集平衡精度为0.59,交叉验证一致率为10/10,但P>0.05。结论:1.TSHR内含子 1 区段的rs 179247,rs2284722,rs 12101261,rs4903964,和rs 17111394 SNP位点与GD易感性相关,rs179247G、rs12101261C、rs4903964G等位基因及单体型GGCG、GACG为GD的保护因素;rs2284722A、与rs17111394C等位基因及单体型AGTA、AATA是GD的发病易感因素。2.CTLA4基因rs231726 SNPs与GD易感性相关,等位基因A是GD发病的危险因素,rs231804,rs1024161和rs231726构成的四种单体型中AAA是GD易感的危险因素。3.FCRL3 rs3761959位点单核苷酸多态性与GD易感性无关。4.rs179247、rs12101261、rs4903964 位点 SNPs 可能与 GD 真实关联;TSHR 基因与CTLA-4基因、FCRL3基因间无交互作用。