【摘 要】
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近年来,具有多基因聚合性状的转基因作物正在快速发展,然而某些重要作物转化效率低、转化周期长,已经成为转基因育种的一个限速步骤。WUS(WUSCHEL)是一个homeobox转录因子,是维持
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近年来,具有多基因聚合性状的转基因作物正在快速发展,然而某些重要作物转化效率低、转化周期长,已经成为转基因育种的一个限速步骤。WUS(WUSCHEL)是一个homeobox转录因子,是维持干细胞处于未分化状态的关键因子,WUS基因的表达区域决定了植物干细胞数量的多少。通过调控WUS的表达提高植物的转化效率,结合基因定点叠加删除技术,从而建立一套高效的转基因体系,这个体系将有助于研发位点特异性聚合性状转基因作物。 本研究首先以水稻为模型测试实验设计的可行性,优化了水稻转化体系,提高了水稻的转化效率(第二章)。首先,构建水稻转化载体,将玉米Wuschel2基因(以雌二醇诱导的XVE系统调控)、重组酶cre基因(以大豆热诱导HSP基因的启动子启动)及筛选标记nptⅡ基因和报告基因DsRed串联,并在报告基因DsRed和诱导型启动子系统XVE间克隆重组位点lox,这个重组位点与目标株系中的lox位点配合,用于重组酶Cre介导非必要外源DNA的删除。通过基因枪将此载体和整合酶Bxb1载体转入水稻起始目标系,在遗传转化过程中,添加诱导剂雌二醇能够激活玉米Wuschel2的表达,且通过一系列测试发现在分化培养基中添加雌二醇可使水稻愈伤的再生率从39%(无诱导剂)提高到52%;另一方面,经分子检测筛选出定点叠加且为单拷贝的转基因植株,对其进行热激处理启动重组酶Cre,结果显示,重组酶Cre可成功介导非必要基因(WUS、nptⅡ等)的删除,最后得到只含DsRed的转基因植株,为获得由重组酶介导的位点特异性整合且只含性状基因的转基因植株提供了一个更有效的方式,也为后续研发其他作物的高效转化体系提供了实验依据。 本研究以棉花为实验材料,旨在筛选出对优化棉花转化体系效果最好的棉花WUS基因(第三章)。根据与拟南芥WUS基因亲缘关系的远近,挑选出6个棉花WUS同源基因,将它们和GFP以融合基因的形式分别构建相应的过表达载体,再经农杆菌侵染体系将载体转入棉花,最后通过GFP检测和PCR分析获得了一批棉花转化愈伤组织以及转基因植株,由于棉花转化周期较长,这6个WUS同源基因对遗传转化的作用有待评估。
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