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目前，恶性肿瘤的发病率和死亡率在我国都呈增加趋势，据统计资料显示恶性肿瘤已成为我国城市居民死因的第一位。因此，恶性肿瘤的预防和治疗已成为现阶段研究的焦点。恶性肿瘤不仅生长迅速，而且能够发生局部侵润，迁移蔓延到身体的其他部位，这是恶性肿瘤最重要的生物学特点。它不仅是导致患者死亡的主要原因也是癌症治疗中的最大障碍，因此目前的研究主要集中在其发生发展的机制，以寻求治疗癌症的突破点。EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）作为肿瘤侵袭与转移的重要参与者，使细胞之间的连接与肿瘤的发生产生了新的联系。EMT过程中细胞间的紧密连接出现了功能障碍，细胞与细胞之间的粘附和细胞的极性丧失，细胞的迁移和侵袭能力增强，这与肿瘤的转移过程机制相同。EMT的发生涉及多种信号途径的相互作用，其中Notch信号通路是诱导EMT发生的主要信号途径之一。Notch∕RBP-Jk信号途径是进化上高度保守的一条信号通路途径，通过介导相邻细胞间的相互作用而与多种生理及病理过程密切相关，其异常活化与多种肿瘤的发生密切相关。多项研究结果表明Notch信号途径的活化可以促进EMT过程的发生，而且下调Notch信号途径则可引发相反的过程，并抑制细胞的迁移和侵袭能力，但其具体作用机制尚不清楚。RBP-Jk是Notch信号途径中最主要的下游效应物，Notch信号途径的活化是依赖于RBP-Jk介导的转录激活下游基因而实现的。在对Notch信号途径的研究中发现LIM结构域蛋白KyoT2（鼠源）可以与RBP-Jk相互作用形成复合物，进而竞争性抑制RBP-Jk介导的Notch下游基因的转录，阻断Notch的活化。FHL1C，KyoT2人的同源物，是FHL1蛋白的一种亚型，属于LIM蛋白家族中的LIM-only蛋白。它包含氨基端的两个半LIM结构域和和羧基端的RBP-Jk结合位点。含有LIM结构域的蛋白不仅在不同的细胞进程中具有重要的作用，比如细胞骨架组织，信号传导，基因表达和细胞分化等，而且是一个蛋白间相互作用的基序。这种相互作用能够显示不同的功能，从而在细胞组织结构的维持以及信号通路等中发挥作用。我们研究组前期通过在对KyoT2抑制RBP-Jk介导的转录机制的深入研究过程中，以KyoT2为诱饵蛋白通过酵母双杂交实验得到了人类紧密连接蛋白ZO-2，并初步验证了KyoT2与ZO-2的相互作用位点。本实验首先通过哺乳动物双杂交实验验证ZO-2与KyoT2在体内的是否有相互作用，后又以FHL1C为目的蛋白通过免疫沉淀实验在FHL1C和RBP-Jk共转组中拉下了人类紧密连接蛋白ZO-1。ZO-1和ZO-2属同一蛋白家族，在上皮和内皮细胞间的连接中具有重要的作用。并且在EMT发生的过程中，ZO-1和ZO-2都为重要的参与者，但是它们参与的过程是通过何种机制发生的，目前尚不清楚。因此基于以上研究结果我们分析，通过与FHL1C（鼠源的KyoT2）相互作用蛋白的检测结果，推测ZO-1可能通过Notch信号途径而参与EMT的发生过程。目前，我们共进行了如下实验。主要研究结果：1.分三段成功克隆了小鼠紧密连接蛋白ZO-2开放读码框全长基因，并将其连入哺乳动物双杂交系统质粒pCMX-VP16中，分别构建了分段和全长的pCMX-VP16-F1R1,pCMX-VP16-F2R2,pCMX-VP16F3R3和pCMX-VP16-ZO的真核表达质粒。2.为了证实KyoT2和紧密连接蛋白ZO-2之间在体内是否存在相互作用及确定其作用位点，在Cos7细胞系中进行了KyoT2与ZO-2之间分段以及全长的哺乳动物双杂交实验，结果分析表明它们未能激活下游的报告基因的活性，即KyoT2和ZO-2在体内可能没有相互作用关系。通过实验结果分析，原因可能为：1，酵母双杂交试验有一定的假阳性结果。2，在体外通过GST-pull-down验证的蛋白质之间的相互作用在体内不一定有作用。但是LIM结构域是蛋白质间相互作用的界面，我们设想KyoT2在通过其RBP-Jk结合位点竞争性抑制NIC的转录激活作用外，还可能通过其LIM结构域向RBP-Jk募集其它转录调控分子。因此我们想要通过FHL1C进一步寻找与其相互作用的新蛋白以期更明确的阐明阻断Notch信号途径的作用机理并为设计优化新型的Notch信号阻断剂奠定理论基础。因此接下来又进行了如下实验：主要研究成果1.通过在293T细胞系中瞬时转染真核表达载体pCMV-myc-FHL1C48小时后，用Western-blot成功检测到带myc标签的过表达蛋白FHL1C。2.通过免疫沉淀，银染色确定有相互作用的新蛋白，并在质谱分析结果中我们在FHL1C和RBP-Jk共转组中成功发现了拉下的新的相互作用蛋白人类紧密连接蛋白ZO-1。综合以上结果分析，ZO-1和ZO-2同属于紧密连接蛋白家族，且ZO-1和ZO-2之间通过相互结合共同定位在上皮细胞的紧密连接处的质膜内，并且已有研究表明ZO-1和ZO-2都为上皮间充质转化EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）发生的相关分子，ZO-1从质膜向胞质的异位和功能失调可以诱导MDCKⅠ细胞发生EMT，这将为我们进一步研究它们之间的关系及参与EMT发生过程的机制开辟一条新路，并将为进一步的实验研究奠定坚实的基础。