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目的:弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)根据细胞起源不同分为活化B细胞型DLBCL(ABC-DLBCL)、生发中心B细胞型DLBCL(GCB-DLBCL)和未分类型,ABC型预后差且易侵犯骨髓。经过临床规范一线治疗R-CHOP样方案治疗后,仍有约30%患者转为复发/难治性DLBCL(Relapsed/Refractory DLBCL,RR-DLBCL)。本研究旨在鉴定可能用于预测R-CHOP治疗后复发/难治性ABC-DLBCL患者的骨髓分子标志,并在体外构建对利妥昔单抗耐药的ABC-DLBCL细胞株,为解决临床上ABC-DLBCL对利妥昔单抗的耐药问题提供实验基础。方法:收集2009年1月至2016年1月在中国医学科学院肿瘤医院就诊的202例初诊ABC-DLBCL患者的骨髓涂片,通过免疫细胞化学检测骨髓涂片的蛋白表达。所有患者均在完成规范一线化疗后,每三个月定期复查一次,以确定是否复发或进展。采用低浓度递增法在体外构建对利妥昔单抗耐药的人ABC-DLBCL细胞株SU-DHL-2-R。流式细胞术检测亲本和耐药细胞表面CD20的表达量,补体依赖的细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC),蛋白质印迹法检测亲本细胞和耐药细胞内凋亡调节蛋白的表达量。通过蛋白质组学技术找出耐药细胞株与亲本细胞系的差异表达蛋白,利用KEGG等数据库进行后续生物信息学分析。结果:本研究在骨髓样本中检测耐药发生的多条信号通路中的关键分子,在骨髓涂片中阳性率较高的蛋白依次是STAT3(46.0%)、NF-κB(38.6%)、SYK(38.1%)、BTK(28.2%)、Bcl-2(23.3%)、Pax5(21.2%)。NF-κB、STAT3、Bcl-2、Pax5、SYK 和BTK可在同一病例同时呈现两种蛋白阳性表达。蛋白表达阳性组合发生耐药病例比率明显高于蛋白表达阴性组合,并且STAT3/NF-κB组(P=0.005);Bcl-2/STAT3组(P=0.009);Bcl-2/Pax5 组(P=0.003)和 BTK/SYK 组(P<0.001)的双阳性蛋白表达组合与双阴性蛋白表达组合的2年无复发生存率有显著差异。通过一系列表型检测鉴定耐药细胞株(SU-DHL-2-R)构建成功,并且蛋白质组学结果发现,与亲本细胞SU-DHL-2-WT相比,利妥昔单抗耐药细胞株SU-DHL-2-R中上调(fold change>2)的蛋白有45个,下调(fold change<0.5)的蛋白有77个。GO分析提示差异蛋白生物学行为表现主要集中B细胞分化、钙黏蛋白结合、DNA损伤,细胞凋亡等方面。KEGG通路分析提示耐药细胞与亲本细胞的差异蛋白主要在B细胞受体信号通路和HIF-1信号通路明显富集。结论:ABC-DLBCL患者骨髓涂片中的蛋白表达阳性组合有助于预测患者复发耐药,同时在体外成功构建利妥昔单抗耐药细胞株。本研究为进一步研究利妥昔单抗耐药及耐药后二线治疗提供了理论依据。