疼痛是一种常见的临床症状，很多病理性疼痛本身就是一种严重影响患者生活质量的疾病。对于慢性疼痛的治疗，传统的药物镇痛有诸多不可避免的缺陷，尤其是长期用药所致的药物耐受及依赖，将直接导致治疗的失败，因此寻找一种安全有效、作用持久的镇痛方法已成为疼痛研究的重要方向。转基因细胞移植镇痛是近年来疼痛研究的新领域，有望为疼痛治疗提供一种全新的技术和方法。神经前体细胞（neural progenitor cell，NPC）是一类可以分裂增殖、自我更新并具有多分化潜能的细胞。NPC作为神经细胞的种子细胞，在细胞移植治疗和细胞介导的基因治疗中具有潜在的临床应用价值。但原代培养的NPC增殖速度较慢，传代周期长，且为多克隆起源，难以满足科研和临床研究的需要。而永生化神经前体细胞在体外培养中能够自我更新和无限扩增，可以提供大量表型、基因型稳定的神经前体细胞，是转基因治疗的理想细胞载体。脑啡肽是一种内源性的阿片肽，由前脑啡肽原经酶切加工而来，广泛分布于外周和中枢神经系统，是中枢神经系统重要的镇痛介质。本研究旨在构建人前脑啡肽原基因（human preproenkephalin gene，hPPE）修饰的永生化大鼠神经前体细胞株，并通过将其移植入神经病理性痛大鼠蛛网膜下腔，以评价其用于镇痛治疗的有效性和安全性。研究方法与结果1、猿肾病毒40大T抗原永生化大鼠神经前体细胞株的构建方法：采用贴壁法体外培养新生鼠室管膜下区神经前体细胞，利用脂质体介导的基因转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原（simian virus 40 large tumor antigen，SV40Tag）基因的质粒pCMVSV40T／PUR转染神经前体细胞，经嘌呤霉素筛选，阳性克隆扩大培养并进行连续传代。观察细胞的形态及其生长状况，应用巢蛋白抗体进行细胞鉴定，5％胎牛血清诱导细胞分化后，应用免疫细胞化学法检测其分化能力。采用RT-PCR、Southern印迹杂交和免疫细胞化学法检测SV40Tag在转染细胞中的表达。结果：体外成功培养神经前体细胞，细胞巢蛋白表达阳性，可诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞；转染SV40Tag后经筛选培养后获得1个阳性细胞克隆，免疫细胞化学结果显示细胞的巢蛋白和微管相关蛋白2染色为阳性，增殖能力较强。5％胎牛血清可诱导转染细胞分化为微管相关蛋白2阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。Southern印迹杂交结果显示转染细胞基因组中存在SV40Tag cDNA，并可检测到SV40Tag mRNA及其蛋白的表达。转染细胞经扩大培养，命名为永生化神经前体细胞（immortalized neural progenitor cell，INPC）。2、永生化大鼠神经前体细胞生物学特性研究方法：选用连续传代培养的INPC，观察传代、冻存和复苏对细胞形态及生长状况的影响，透射电镜观察细胞的超微结构，应用细胞生长曲线、5’溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU）掺入法和流式细胞仪检测细胞增殖能力，采用裸鼠接种实验检测细胞的致瘤性，通过检测细胞分化前后MHCⅠ和Ⅱ类分子的表达评价其免疫原性。结果：贴壁培养的INPC形态以椭圆形或三角形为主，有两个或三个短的突起。细胞胞体较小，胞核较大，呈圆形，胞浆较少。细胞呈单层生长，存在接触抑制现象。冻存与复苏不改变INPC细胞的形态及增殖能力，目前已传至50余代。与原代NPC相比，INPC细胞增殖指数和增殖率升高，群体倍增时间缩短。裸鼠接种实验未见有新生物长出。在常规培养条件下，有少量的INPC表达MHCⅠ和Ⅱ类分子，而5％胎牛血清诱导INPC分化后，MHCⅠ和Ⅱ类分子的表达均为阴性。3、人前脑啡肽原基因修饰永生化大鼠神经前体细胞株的构建方法：携带hPPE的重组腺相关病毒2型（recombinant adeno-associated virus type 2，rAAV₂）rAAV₂／hPPE和含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）的对照载体rAAV₂／eGFP分别转染INPC，转染rAAV₂／eGFP 12h后开始应用倒置荧光显微镜观察转rAAV₂／eGFP INPC绿色荧光蛋白的表达，并计算转染效率，应用巢蛋白抗体和猿肾病毒40抗体进行细胞鉴定。5％胎牛血清诱导转rAAV₂／hPPE INPC分化后，应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力。采用免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法检测转染细胞hPPE、亮氨酸脑啡肽（Leu-enkephalin，L-EK）的表达与分泌。结果：INPC转染rAAV₂／eGFP 12h后即有绿色荧光蛋白表达，转染72h后，大部分细胞表达绿色荧光蛋白，转染效率可达90％。免疫细胞化学结果显示INPC转染rAAV₂／hPPE后nestin和SV40抗体染色均为阳性，且可被血清诱导分化为神经元和星形胶质细胞。免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法结果均表明转rAAV₂／hPPE永生化神经前体细胞hPPE的表达与L-EK的分泌均明显高于未转染细胞（P＜0.01）。4、慢性神经病理性痛大鼠鞘内移植人前脑啡肽原基因修饰永生化大鼠神经前体细胞的镇痛效应方法：成年雌性SD大鼠40只，随机分为五组：Naive组，大鼠不进行任何处理；Sham组，大鼠仅暴露右侧坐骨神经分支；SNI组，大鼠右侧下肢行保留性神经损伤（spared nerve injury，SNI）手术；INPC组和INPC／hPPE组大鼠分别于SNI术后1周鞘内移植BrdU标记的永生化神经前体细胞INPC或转rAAV₂／hPPE永生化神经前体细胞（INPC／hPPE）。持续观察大鼠行为学改变，分别于SNI术前、SNI术后1周至细胞移植后8周内每周测定各组大鼠50％机械缩爪阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）和热缩爪潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）。于细胞移植8周后取各组大鼠L_4-6脊髓组织，应用免疫组织化学法检测移植细胞BrdU和L-EK的表达，采用RT-PCR和放射免疫法检测hPPE、L-EK的表达及分泌。结果：SNI术后1周，大鼠出现疼痛行为学症状，MWT和TWL降低（P＜0.05）；细胞移植后1周，INPC／hPPE组大鼠疼痛行为学症状明显减轻，MWT和TWL升高（P＜0.05），到细胞移植后第3周，已基本恢复至正常水平。细胞移植后8周，INPC组和INPC／hPPE组大鼠脊髓背角软脑膜和脊髓浅层中均可检测到移植细胞BrdU染色，免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法结果均表明INPC／hPPE组hPPE的表达和L-EK的分泌高于其它四组（P＜0.05）。5、统计学处理采用SPSS10.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差（（?）±S）表示，组内、组间比较采用单因素方差分析；计数资料以率表示，组间比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。研究结论成功地构建了猿肾病毒40大T抗原永生化的大鼠神经前体细胞株，该永生化细胞保留了原代NPC的细胞表型，为良性转化细胞，体内外实验证实可作为载体细胞安全地用于转基因细胞移植研究；构建了高表达亮氨酸脑啡肽的人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠神经前体细胞株，将此细胞植入慢性神经病理性痛大鼠蛛网膜下腔，可获得长效、稳定、安全的镇痛效果。研究总结本研究采用脂质体介导的基因转染技术成功地构建了永生化大鼠神经前体细胞株，并对细胞的生物学特性进行了全面的研究，该细胞株的成功构建解决了原代细胞培养数量不足及生存时间有限的问题，为中枢神经系统疾病的治疗与转基因细胞移植提供了安全、可靠的细胞平台，永生化细胞构建技术具有良好的临床应用前景。抗痛基因修饰的永生化神经前体细胞进行鞘内移植可有效缓解慢性神经病理性痛，是一种安全、有效、可行的细胞镇痛方法，这不仅是对顽固性疼痛治疗所进行的一次探索性研究，而且可为基因治疗应用于临床奠定了基础。