论文部分内容阅读
背景:甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)是一种中枢神经系统兴奋剂,长期滥用易对中枢神经系统产生毒性作用。神经元凋亡是METH发挥其毒性作用的机制之一。对于METH引起的神经毒性损伤目前尚无有效的治疗药物。八肽胆囊收缩素(octapeptide cholecystokinin,CCK-8)是一种脑肠肽,我室近十年的研究发现CCK-8具有拮抗METH诱导的氧化应激和神经炎症作用,也对吗啡诱导的神经元凋亡具有保护作用。胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)受体是CCK-8在中枢和外周的作用靶点,有CCK1受体(CCK1 receptor,CCK1R)和CCK2受体(CCK2 receptor,CCK2R)两种亚型。我室在用CCK-8干预吗啡的研究中发现,CCK1R是低敏性受体,CCK2R为高敏性受体,即高剂量CCK-8可激活CCK1R发挥作用,而低剂量CCK-8可激活CCK2R发挥生物学功能。吗啡与METH的作用类型和性质不同,而CCK-8及其CCK受体亚型对METH诱导的神经元凋亡是否发挥保护作用尚未见报道。CCK受体属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)。β-arrestin可作为GPCR的信号传感器,发挥抗凋亡或促凋亡的作用。β-arrestin在CCK-8对METH诱导神经元凋亡中机制如何目前也未见报道。目的:本研究旨在阐明CCK-8对METH诱导SH-SH5Y细胞凋亡的保护作用及机制,并进一步阐明β-arrestin2是否介导CCK-8抑制METH致SH-SH5Y细胞凋亡的偏向激动作用。理解CCK-8对METH神经毒性的作用机制将为防治METH滥用致神经损伤提供新思路。方法:应用Annexin-V-FITC/PI流式染色和Hoechst33258染色检测SH-SH5Y细胞凋亡率变化。Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达变化。慢病毒稳定转染构建HEK293-CCK1R细胞系和HEK293-CCK2R细胞系,以探讨不同CCK受体亚型在CCK-8抑制METH诱导神经元凋亡中的作用。脂质体转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低SH-SH5Y细胞的β-arrestin2,进一步明确CCK-8发挥抗凋亡作用时β-arrestin2在CCK受体下游的作用。研究数据应用SPSS 21.0软件分析,结果表示为均数±标准误(mean±S.E.M.),各组间均数比较行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用最小显著差异t检验(即LSD-t检验)进行两两比较,以P<0.05为有统计学差异。结果:1.流式细胞术结果显示一定浓度CCK-8预处理可逆转METH诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率增加;Hoechst33258染色结果显示METH给药前先用CCK-8预处理使不规则致密浓染的凋亡细胞核数目相比METH单独处理组显著降低。提示在细胞水平CCK-8发挥对METH诱导神经元凋亡的保护作用。2.METH诱导SH-SY5Y细胞促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase3表达上调;对抗凋亡蛋白Bcl2表达没有明显影响;Bax/Bcl2比值增加。而METH给药前用CCK-8预处理则不同程度地逆转了METH诱导的SH-SY5Y细胞凋亡蛋白的上述改变。提示在分子水平CCK-8对METH诱导神经元凋亡具有保护作用。3.CCK-8预处理对METH诱导HEK293-CCK1R细胞系的Bax、Cleaved Caspase3蛋白表达上调以及Bax/Bcl2增加均没有影响,但能逆转METH诱导HEK293-CCK2R细胞系的Bax、Cleaved Caspase3蛋白表达上调以及Bax/Bcl2增加。提示CCK2R可能是CCK-8发挥对METH致神经元凋亡的保护作用的作用靶点。4.在siRNA干扰了β-arrestin2的SH-SY5Y细胞中,CCK-8预处理对METH诱导SH-SY5Y的Bax、Cleaved Caspase3蛋白表达上调以及Bax/Bcl2增加均没有明显影响。提示β-arrestin2可能介导了CCK-8保护METH诱导神经元凋亡的偏向激动作用。结论:1.CCK-8对METH诱导SH-SY5Y细胞凋亡发挥保护作用。2.CCK-8可能通过与CCK2R结合发挥对METH诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用;β-arrestin2可能在这一保护过程中介导偏向激动作用。