桃蔗糖转运蛋白基因的克隆与原核表达

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我国是世界上桃[Prunus persica (L.) Batsch.]的原产地,桃在人民生活和园艺产业占有非常重要的地位。近年来,随着生产的发展和人民生活水平的提高,品种更丰富、品质更优越的桃的生产成为我国北方落叶果树中非常重要的课题之一。所有果实品质和产量很大程度上决定于果实内所含碳水化合物的种类和数量,桃果实的产量和品质也高度依赖于糖类的装载和卸载水平。蔗糖是同化物从源到库的长距离运输的主要形式,而蔗糖的装载、卸载和分配则主要依赖于膜上的蔗糖转运蛋白,但目前关于桃等核果类植物中是否存在有功能的蔗糖转运蛋白介导糖类的跨膜运输并不清楚。尤其是库器官中碳水化合物从韧皮部卸出以及此后的代谢途径和分子机理还不甚明了。本文报道了一个蔗糖转运蛋白新基因,并对该基因的结构特点、表达特征进行分析,进而构建了原核表达载体,诱导融合表达,为深入研究该基因功能奠定了基础。主要研究结果如下:(1)各组织总RNA的提取。桃叶片总RNA的提取采用改良Trizol法;果实总RNA的提取采用CTAB法;枝条韧皮部、花瓣、萼片等组织总RNA的提取采用SDS-苯酚法;得到了完整性好,无降解,纯度高,28S和18S条带分离清楚的总RNA,能满足实验要求。(2)桃蔗糖转运蛋白基因的克隆和序列分析。克隆的桃蔗糖转运蛋白基因包含一个完整的开放阅读框(ORF),长度1500bp,编码499个氨基酸,具有12个跨膜区,41个氨基酸的中央胞质环,分子量约为53.48kD,等电点为9.23,属于碱性蛋白,并且不含信号肽。推导氨基酸序列分析显示,该基因含有保守的蔗糖转运蛋白功能域,属于MFS(Majorfacilitator superfamily)蛋白家族和GPH超家族(GPH family sucrose/H+symporter)中的一员。其氨基酸序列与梨、苹果的同源性最高,都为87%。核苷酸序列分析显示,与苹果的相似性最高,为90%,草莓、大豆、猕猴桃、黄瓜的相似性分别为85%、76%、76%、75%。进行系统进化树聚类分析,结果表明:苹果和梨聚类在同一分支上,但它们编码的氨基酸序列进化距离不同步,后与桃PpSUT1聚为一类,亲缘关系最近;因此推测桃PpSUT1的功能与苹果MdSUT1的功能相似。与牡丹的进化距离较远,说明MFS家族基因编码的氨基酸序列在进化过程中可能存在种属差异性。(3)桃蔗糖转运蛋白的时空表达。应用Real-Time PCR技术来研究桃蔗糖转运蛋白基因在转录水平上的表达特征。在桃的叶片、韧皮部、果实、花瓣、雌蕊、雄蕊、萼片组织中均检测到PpSUT1有表达,并在不同组织不同时期表达量存在明显的差异。桃果实发育过程中蔗糖含量的变化与蔗糖转运蛋白的表达量呈正相关。(4)桃pMAL-c2x-PpSUT1原核表达载体的构建与鉴定。将蔗糖转运蛋白的中央胞质环片段亚克隆到原核表达载体pMAL-c2x中,经菌液PCR鉴定、双酶切鉴定、测序鉴定,确定桃SUT基因插入的位置、大小、方向均正确,证实成功构建了原核表达载体。(5)桃pMAL-c2x-PpSUT1在大肠杆菌中的表达。将获得的重组质粒pMAL-c2x-PpSUT1转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经0.3mmol·L-1IPTG诱导表达,13%SDS-PAGE电泳检测,表达的融合蛋白分子量约为47.0kD,为下一步的抗体制备实验打下基础。
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