第一部分骨髓间充质干细胞来源微泡的生物学特征目的：研究骨髓来源MSC-MV的形态、大小和免疫表型等基本生物学特征以及其内包含的miRNA的表达情况,为今后研究MSC-MV的生物学效应和临床应用潜能奠定基础。方法：培养大鼠骨髓来源MSC并对其进行鉴定：收集MSC条件培养上清,采用梯度离心方法分离提取MSC-MV;扫描电镜及激光共聚焦显微镜观察MSC-MV的形态及大小：通过流式细胞术检测MSC-MV膜表面是否表达MSC特征性表面标志;采用蛋白定量方法比较MSC在应激条件下释放MV的量;miRNA芯片检测MSC-MV内miRNA总体表达水平,通过生物信息学方法了解MSC-MV内miRNA主要参与的生物学过程。结果：我们通过全骨髓贴壁法培养的大鼠骨髓来源MSC表面表达MSC的经典表面标志,并在体外具有成骨、成脂和成软骨分化能力。通过梯度离心方法,我们分离提取了MSC条件培养上清中的MV,扫描电镜和激光共聚焦显微镜检测提示MSC-MV为类球形,直径在100-1000 nm范围之间,并且流式细胞术检测发现MSC-MV表面表达MSC的经典表面标志,说明其能反映母体细胞的膜表面特征。此外,我们还发现MSC在无血清应激条件下释放的MV的量高于正常培养条件下所释放的量,进一步说明细胞在应激条件下释放的MV会增多。最后,我们采用miRNA芯片方法检测MSC-MV内miRNA的表达情况,发现MSC-MV内包含274种已知的大鼠miRNA,并且这些miRNA参与了多种生物学进程的调控,例如转录调控、细胞内信号级联等等。同时,我们通过查阅文献,发现MSC-MV内包含许多miRNA参与调控干细胞分化、血管新生、造血功能、免疫反应等。结论：骨髓来源MSC在体外培养过程中能产生大量MV,这些MSC-MV大小在100-1000 nm之间,表达其母体细胞的特征性标志,并包含多种miRNA,参与调控多种生物学进程。第二部分：骨髓间充质干细胞来源微泡的体外生物学效应目的：骨组织工程应用中,种子细胞在植入体内后常常由于无法及时建立血供易发生凋亡,基于以往文献报道过的其他种属及组织来源MSC-MV的生物学效应,本部分研究拟从血管新生、抗凋亡以及成骨分化三个方面研究大鼠骨髓来源MSC-MV的体外生物学效应。方法：我们以大鼠骨髓来源MSC-MV为研究对象,在体外将MSC-MV与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共同孵育,通过CCK-8检测、划痕实验和matrigel成管实验等方法研究MSC-MV对HUVEC增殖、迁移和成血管能力的影响。此外,我们在体外通过无血清、低氧培养条件模拟种子细胞植入体内后所处的缺血缺氧环境,将MSC-MV与低氧无血清诱导凋亡的MSC共同孵育,通过TUNEL和qRT-PCR方法检测MSC-MV对诱导凋亡的MSC是否具有抗凋亡效应。同时,我们在体外将MSC-MV分别与成骨诱导和未诱导的MSC共同孵育,通过茜素红半定量和qRT-PCR方法检测MSC-MV对MSC自身成骨分化能力的影响。结果：MSC-MV在体外能促进]HUVEC的增殖、迁移和matrigrl成管能力,并且该效应随MSC-MV浓度上升而增强。此外,我们证明低氧无血清培养能诱导MSC凋亡,而MSC-MV不能减少低氧无血清培养状态下的MSC凋亡细胞数,且对MSC凋亡相关基因的表达水平无显著影响。同时,我们还证明MSC-MV不能增强MSC自身的成骨分化能力,并且对MSC成骨相关基因的表达水平无明显影响。结论：大鼠骨髓来源MSC-MV在体外对内皮细胞具有促血管新生效应,对低氧无血清诱导凋亡的MSC无抗凋亡效应,且对MSC自身成骨分化能力无显著影响,为进一步研究MSC-MV在骨组织工程领域的应用潜能奠定基础。第三部分：骨髓间充质干细胞来源微泡在骨组织工程中的应用潜能目的：我们推测MSC-MV能通过促进血管新而提高组织工程骨移植物的骨再生能力。种子细胞、构建方式和生物材料是骨组织工程技术的三个重要因素,我们拟从构建方式和生物材料两方面研究探讨骨髓MSC-MV在骨组织工程应用中的潜能。方法：从构建方式出发,从我们利用藻酸钠凝胶包裹MSC-MV以及成骨诱导后的MSC接种于聚己内酯(PCL)支架材料上,构建了一种细胞+MV+生物材料复合物。从生物材料角度出发,我们利用MSC-MV包被生物材料脱钙骨基质(DBM),制备MV复合生物材料。我们在体外通过相差显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜研究细胞+MV+生物材料复合物和MV复合生物材料的生物学特征。并分别将制备好的细胞+MV+物材料复合物和接种了种子细胞的MV复合生物材料以及相应对照组植入裸鼠皮下异位成骨模型中,通过小动物CT、苏木素-伊红染色和CD31免疫组化染色等方法研究MSC-MV在体内是否能促进血管新生及骨组织再生。结果：我们发现,通过藻酸钠凝胶包裹的方式能使种子细胞均匀的分布于细胞+MV+生物材料复合物中,并且我们所制备的MV复合生物材料上,MV能均匀分布于生物材料上且保持膜结构完整。我们进一步将细胞+MV+生物材料复合物及MV复合生物材料植入裸鼠皮下异位成骨模型,结果显示MSC-MV在体内能促进血管新生及骨组织再生。结论：我们首次利用MSC-MV构建了细胞+MV+生物材料复合物,并制备了MSC-MV复合生物材料。我们还通过体内实验证明,以上两种方式能将MSC-MV成功应用于骨组织工程技术,并且MSC-MV在体内能促进骨再生和血管化。我们的研究提示,MSC-MV在骨组织工程领域具有巨大的应用潜能。