NRIP1调控脂肪间充质干细胞功能在延缓皮肤衰老中作用的初步研究

来源 :中国医学科学院北京协和医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cerlin
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背景
  皮肤衰老是一个连续的动态过程,包括内源性衰老和外源性衰老。临床上,皮肤衰老主要表现为皱纹形成,弹性丧失和色素沉着。组织学上,皮肤衰老的特征是表皮变薄,真皮萎缩,真皮表皮连接处变平,真皮中异常弹性蛋白的积累以及皮下脂肪层变薄。皮肤衰老的发病机制主要包括基因突变、氧化应激、基质金属蛋白酶(MMPs)过度表达、慢性炎症和细胞衰老。研究表明,脂肪间充质干细胞治疗相关皮肤病过程中,注射部位皮肤皱纹、弹性和光泽度得到改善,提示脂肪间充质干细胞在缓解皮肤衰老中可能发挥作用,其具体机制尚不明确。核受体相互作用蛋白1(NRIP1),能够与多种核受体相互作用来调节基因表达,从而参与体内代谢、衰老和其他生理过程。我们之前的研究发现,NRIP1作为衰老相关基因,在敲除Nrip1后可延长雌性小鼠寿命,同时发现其能够缓解脂肪细胞衰老,由此我们推测NRIP1可能能够通过调控脂肪间充质干细胞功能从而延缓皮肤衰老。
  目的
  本研究利用不同年龄段C57BL/6J小鼠以及相同年龄段Nrip1-/-小鼠和Nrip1+/+小鼠,分离培养以上三类小鼠来源ADMSCs,研究NRIP1对小鼠皮肤衰老表型的影响,探索NRIP1对ADMSCs细胞增殖、衰老和分化功能的影响,揭示NRIP1如何影响ADMSCs细胞周期,进而延缓皮肤内源性衰老的相关机制,进一步明确NRIP1对皮肤内源性衰老的影响,为防治皮肤老化提供有效的新靶点。
  方法
  1.琼脂糖凝胶电泳明确小鼠基因型,选取不同年龄段C57BL/6J小鼠以及相同年龄段Nrip1-/-小鼠和Nrip1+/+小鼠背部皮肤,采用HE染色和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性检测皮肤衰老表型。
  2.分离培养不同年龄段C57BL/6J小鼠来源ADMSCs,MTT法检测细胞增殖、AnnexinⅤ法检测细胞凋亡、集落形成实验(CFU)检测细胞集落形成能力,采用SA-β-Gal活性检测细胞衰老功能,诱导ADMSCs成脂分化后,油红O染色检测成脂分化情况和qRT-PCR检测脂肪分化相关基因表达。
  3.分离培养相同年龄段Nrip1-/-小鼠和Nrip1+/+小鼠来源ADMSCs,MTT法检测细胞增殖、AnnexinⅤ法检测细胞凋亡、CFU检测细胞集落形成能力,采用SA-β-Gal活性检测细胞衰老功能,诱导ADMSCs成脂分化后,油红O染色检测成脂分化情况和qRT-PCR检测脂肪分化相关基因表达,PI染色法检测细胞周期,细胞免疫荧光检测细胞静止状态。
  4.构建Nrip1基因敲除ADMSCs和siRNA靶向Nrip1基因敲低ADMSCs,qRT-PCR法在基因敲除和敲低细胞中检测衰老相关基因、衰老细胞分泌表型(SASP)和NFκB通路相关基因表达,WesternBlotting法在siRNA靶向Nrip1基因敲低ADMSCs中检测相应蛋白水平。免疫组化法在皮肤标本中检测p-p65的水平。
  结果
  1.与年轻组B6小鼠相比,老年组小鼠真皮和皮下脂肪层厚度明显变薄,皮下脂肪层SA-β-Gal阳性染色细胞百分比显著升高。与Nrip1+/+小鼠相比,Nrip1-/-小鼠真皮和皮下脂肪层厚度显著增厚,皮下脂肪层SA-β-Gal阳性染色细胞百分比显著降低。
  2.与年轻组ADMSCs相比,老年组ADMSCs增殖能力显著降低,凋亡细胞百分比显著升高,集落形成数量显著降低,细胞衰老中SA-β-Gal染色阳性率显著升高,油红O染色吸光度显著降低,成脂分化相关基因(Pparγ、Fabp4和Adiponectin)表达显著降低。
  3.与Nrip1+/+小鼠来源ADMSCs相比,Nrip1-/-小鼠来源ADMSCs增殖能力显著降低,凋亡细胞百分比显著降低,集落形成数量显著降低,细胞衰老中SA-β-Gal染色阳性率显著降低,油红O染色吸光度显著降低,成脂分化相关基因(Pparγ、Fabp4和Adiponectin)表达显著降低,G0/G1期的细胞数量明显升高,S期和G2/M期的细胞数量明显降低,静止期细胞数量显著升高。
  4.与Nrip1+/+和siConADMSCs相比,Nrip1-/-和siNrip1ADMSC中衰老相关基因(p21和p53),SASP(IL1a和IL6)和NFκB通路相关基因(p65、mTOR、Igf1)的表达均显著降低,p16表达显著升高。与siConADMSCs相比,siNrip1组mTOR、p65和p-p65蛋白水平明显降低。老年组B6小鼠皮肤p-p65蛋白水平比年轻组明显升高,Nrip1-/-小鼠皮肤p-p65蛋白水平比Nrip1+/+明显下降。
  结论
  1.在B6小鼠中验证了皮肤衰老相关表型,包括真皮层和皮下脂肪层厚度逐渐变薄,皮下脂肪层衰老细胞数量增多。
  2.Nrip1基因敲除能够增加真皮和皮下脂肪层厚度,并且减少皮下脂肪衰老细胞的积累,从而延缓皮肤衰老。
  3.在B6小鼠来源ADMSCs中,发现ADMSCs细胞功能随衰老而逐渐下降,表现为:衰老细胞数量上升,细胞凋亡增加,细胞增殖、自我更新和成脂分化功能下降。
  4.Nrip1基因敲除能够延缓ADMSCs细胞衰老,抑制细胞凋亡,并使细胞维持静止状态,从而保护其细胞增殖、自我更新和成脂分化能力。
  5.敲除Nrip1能够通过抑制p53、p21和SASP(IL-1a和IL-6)来抑制ADMSCs细胞衰老,同时下调mTOR表达来维持细胞静止状态,进一步可能通过IGF1/mTOR/NFκB信号通路延缓皮肤衰老。
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