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脑胶质瘤是一类常见的原发性恶性中枢神经系统肿瘤,严重威胁人类的健康和生命,是当前神经科学迫切需要解决的问题。目前大部分恶性胶质瘤的预后很差,尽管在早期诊断、手术治疗和放射治疗方面已有长足发展,但其中位生存期只有14个月,并且5年生产率不足2%。另外,由于大部分治疗并非选择性针对肿瘤细胞导致很多正常脑组织也受到损伤,所以对于胶质瘤的治疗不但需要杀死所有肿瘤细胞,还需要有足够的能力分辨正常组织和肿瘤细胞。14-3-3蛋白属于小分子多功能酸性二聚体蛋白,在几乎所有真核细胞中均有表达,具有高度的保守性。14-3-3蛋白通常在胞质中,但是也存在胞核、高尔基体和细胞膜中。哺乳动物细胞中有7个亚型(ζ,β,η,ε,θ,γ和σ),另外还有两种在酵母菌和果蝇中,15种在拟南芥植物属。14-3-3蛋白α和δ分别是β和ζ的磷酸化形式。14-3-3蛋白作用机理非常多,在不同的细胞信号通路中有超过200个14-3-3配体分子与其结合。同时14-3-3蛋白在细胞凋亡、DNA复制、细胞分化、增殖、细胞转化、信号传导和细胞周期调控等过程中发挥了重要作用。我们前期研究发现14-3-3蛋白在正常胶质细胞中低表达,而在胶质瘤细胞系和胶质瘤组织中高表达,而14-3-3ζ亚型在胶质瘤细胞中呈明显的高表达。目前,靶向14-3-3ζ的胶质瘤基因治疗实验研究报道较少。基于此,本课题在此方向进行了探讨。一、人14-3-3ζ基因shRNA真核表达载体pSilencer-14-3-3ζ的构建和鉴定采用Primer 5.0软件,根据人14-3-3ζ的cDNA序列和干涉载体的设计要求,设计两条核苷酸链序列。每条长64nt,两端分别含有BamH I和Hind III的酶切位点。将合成的两条寡核苷酸退火后形成的双链DNA片段从BamH I和Hind III两个酶切位点克隆到质粒载体pSilencer3.1-H1neo载体中,新的质粒命名为pSilencer-14-3-3ζ。双酶切鉴定及测序,证明克隆正确。二、稳定转染细胞系的建立构建好干涉载体pSilencer-14-3-3ζ和阴性对照载体通过脂质体介导的基因转染方法分别转染入人类胶质母细胞瘤系U251中,进行细胞克隆。随机挑选30个克隆继续扩大培养,备后用。三、Western blot与RT-PCR检测14-3-3ζ蛋白表达水平通过Western blot和RT-PCR检测,干涉载体pSilencer-14-3-3ζ组细胞的14-3-3ζ蛋白和RNA表达水平有显著抑制,与阴性对照载体组细胞及U251平行对照组的14-3-3ζ蛋白和RNA表达水平有明显差异。综上所述,本实验在胶质瘤细胞系U251中成功构建了稳定整合性14-3-3ζ基因RNA干涉载体,为进一步研究14-3-3ζ的作用机制打下了实验基础。