论文部分内容阅读
食管癌是世界范围内最为常见的六大恶性肿瘤之一。河南省林县以及临近县是公认的世界上食管癌发病率最高的区域,男性的死亡率为161/10万人,女性的死亡率为103/10万人。尽管经过多年的研究我们已经在食管癌治疗方面有了很大的进展,但是其五年生存率仍然不到10%。Ephrin和Eph信号已确定在许多人类癌症中发挥作用,如肺癌,乳腺癌,前列腺癌,黑色素瘤,白血病等,在很多肿瘤中Ephrin和Eph的表达变化与肿瘤的生长、存活、血管生成和转移相关。材料与方法1.样本采集及病理资料收集抽取2007和2008两年间在林县肿瘤医院就医的食管癌患者为研究对象,采集患者术后食管癌组织及其匹配的正常食管组织。共采集标本92对。开展现场问卷调查,收集患者临床病理资料进行统计分析。2.组织中ephrinA5和EphA3 mRNA表达水平的测定通过荧光定量PCR方法测定食管癌组织及其对应的正常食管组织中ephrinA5和EphA3基因mRNA的表达水平,以β-actin作为内参基因。模板的含量用目的基因模板的循环阈值来衡量。3.组织中ephrinA5和EphA3蛋白表达水平的检测通过Western blot和免疫组织化学染色法测定食管癌患者癌组织及其匹配的正常组织中ephrinA5和EphA3蛋白表达水平。免疫组织化学法染色后,在200倍显微镜下观察标本染色最强的3个视野,计算其阳性细胞百分比,以食管癌组织中阳性细胞比与匹配正常食管组织中阳性细胞比的比值作为该患者蛋白表达水平指标。4.EphrinA5对食管癌细胞生长影响的检测首先,通过Western blot检测在人类食管癌细胞系中ephrinA5蛋白表达水平,最后选定ephrinA5蛋白表达水平相对最低的Eca-109细胞系,过表达外源的ephrinA5,并通过G418筛选,最终得到只转染了空载体的对照细胞,以及具有较低和较高的ephrinA5表达水平的两株单克隆细胞,用Western blot方法检测ephrinA5蛋白的表达水平。通过MTT实验检测ephrinA5对Eca-109食管癌细胞生长的影响。5.统计学分析运用SPSSI2.0软件对数据进行统计分析,对△(ACt)进行配对t检验和相关分析。对食管癌样本ephrinA5、EphA3基因mRNA和蛋白的表达水平和临床参数间的关系采用χ2检验,以a=0.05作为检验水准。结果1.荧光定量PCR结果1.1 ephrinA5和EphA3基因mRNA表达水平荧光定量PCR结果显示,与匹配正常食管组织相比,在92例食管癌样品中,ephrinA5 mRNA在66.3%(61例)的食管癌组织中表达下调,EphA3 mRNA在63.0%(58例)的食管癌组织中表达下调。配对t检验表明ephrinA5 mRNA在食管癌组织的表达比正常食管组织显著下调(t=3.938,P<0.01),EphA3 mRNA在食管癌组织的表达比正常食管组织也显著下调(t=3.747,P<0.01)。1.2 ephrinA5和EphA3 mRNA与临床病理相关因素的关系EphrinA5 mRNA在不同体积肿瘤中的表达水平差异有统计学意义(χ2=13.874,P<0.01)；淋巴结转移组食管癌组织中ephrinA5 mRNA的表达水平显著低于淋巴结未转移组(χ2=12.959,P<0.01),EphA3 mRNA在有家族史的患者的癌组织的表达低于没有家族史的患者(χ2=4.517,P<0.05)；EphA3 mRNA的表达与性别也有相关性(χ2=6.098,P<0.05)。2.Western Blot、免疫组化结果及ephrinA5、EphA3蛋白与临床病理因素之间的关系淋巴结转移组ephrinA5蛋白表达水平显著低于淋巴结未转移组(χ2=12.165,P<0.01)；肿瘤体积越大,EphrinA5蛋白表达水平越低(χ2=19.812,P<0.01)。男性的EphA3蛋白表达水平显著低于女性(χ2=6.817,P<0.01)；有家族史的患者EphA3蛋白表达水平显著低于无家族史的患者(χ2=4.844,P<0.05)。3.人类食管癌细胞系中ephrinA5的表达情况采用Western blot方法,我们还分析了8种食管癌癌细胞株中ephrinA5蛋白的表达水平。结果显示：Eca-109, KYSE-180, KYSE-510中表达水平较低。我们选取了其中具有极强成瘤能力的Eca-109细胞过表达ephrinA5,以进一步研究其生物学功能。结论1.食管癌组织ephrinA5和EphA3 mRNA及蛋白表达水平显著低于其匹配正常食管组织。EphrinA5 mRNA及蛋白的表达与肿瘤大小、淋巴结转移显著相关,EphA3 mRNA的表达与性别、家族史有相关性。2.食管癌细胞系Eca-109中, ephrinA5表达高的细胞生长速度最慢,ephrinA5表达低次之,转染质粒空载体的细胞生长速度最快。3.EphrinA5和EphA3可能成为食管癌患者基因治疗的一个作用靶点。