研究背景他克莫司(FK506)是一种大环内脂类免疫抑制剂,其作用机制与环孢素A相似,但是分子量更小,更容易渗透进入皮肤。其软膏剂治疗皮肤疾病主要通过阻断钙调神经磷酸酶活化而抑制皮损处T细胞的活化,另外,也可通过调节其它免疫细胞相关因子的释放而改善皮损处的炎症反应。这种抗炎活性与外用糖皮质激素相似,但是,外用他克莫司不具有糖皮质激素那样的副作用。因此,深受皮肤科医师的青睐。然而,由于他克莫司软膏存在一定的系统暴露(系统吸收),长期外用他克莫司有引起潜在系统副作用的可能,甚至存在潜在的致癌作用。由于缺乏长期安全性资料的比较,长期使用他克莫司长期使用的安全性问题倍受关注。为此,美国FDA要求外用他克莫司在包装上加黑框警告,这是FDA关于药物副作用最严厉的警告。研发低毒、低副作用的新药可以缓解药物的安全性问题。但是,越来越多的研究表明,只靠研发新药是远远不够的。原因之一是很多新药在体外具有较理想的理化特性,然而,一旦真正应用到体内,则由于新药所处的理化环境改变,导致其在体内不能很好的发挥作用。因此,药物新剂型的发展成为近几年研究的热点。固体脂质纳米粒(SLN)是继乳剂、脂质体、微粒和毫微粒之后,发展起来的一种新型药物载体系统。它以生理相容性好的可降解的天然或合成无毒类脂为药物载体材料,制成粒径约在50-1000nm的亚微粒给药系统,具有控制药物释放、避免药物降解、毒性低、靶向性好、易于转化为大规模生产等优点。日前,SLN制备方法众多,有高压乳均法、微乳法、溶剂扩散法、乳化蒸发法、膜接触器法等。通过各种工艺处理手段,还可以将固体脂质纳米粒制备成粉针剂、片制、丸剂、胶囊剂、凝胶剂等,以满足对不同给药方式的需求。SLN局部皮肤给药具有许多优点：1.“闭合膜作用”,其增进水合,提高药物对皮肤的穿透率,还能够修补皮肤因炎症或损伤而导致破损的脂膜。2.缓释性,可在表皮形成药物贮存库,缓慢而持久地释放药物；大量SLN在表皮内滞留,使真正进入真皮层药物减少,从而避免了药物全身吸收带来的不良反应。3.无毒性,制备SLN的脂质为生理相容性材料,安全无毒,对皮肤的刺激性小。关于他克莫司脂质体的研究还很少,目前处于起步阶段。在国外,chougule等通过薄膜蒸发及高压乳均技术制备了他克莫司脂质体冻干粉。其他克莫司脂质体粒径为140nm,包封率为96%,zeta电位为1.017mV；他克莫司脂质体冻干粉体外药物持续释放达18小时。在国内,王启平等采用乳化-溶剂挥发技术,用甲氧基聚乙二醇聚乳酸聚合物(PEG-PLA)制备了他克莫司微球,其平均粒径为545nm,平均载药量为18.9%,平均包封率为25%,35天的药物累积释放率为67.21%。在前期的实验中,我们采用改良的溶剂乳化扩散法,也已成功制备他克莫司固体脂质纳米粒(FK506-SLN),其平均粒径为134nm,zeta电位为-25.2±10.3mV,包封率为88.74%,透射电子显微镜显示FK506-SLN圆形,大小均匀,无明显聚集现象。药物体外释放试验显示他克莫司自FK506-SLN释放缓慢持续,药物释放控释性良好。但是,作为局部皮肤外用制剂,其真正的透皮情况是否与此一致?他克莫司固体脂质纳米粒为混悬液,其保湿性及黏附性差,不便于皮肤外用。作为一种外用剂型,将SLN混悬液包封入软膏或凝胶成为必然的选择。水凝胶(hydrogel)是以水分为分散介质的凝胶,是一种良好的局部皮肤给药剂型。很多研究采用卡波姆作水凝胶基质。卡波姆是丙烯酸聚合物,易溶于水形成酸性胶体,无毒无刺激性,与皮肤有良好的耦合性。随着小鼠皮炎模形发展成熟,将外用制剂用于小鼠模型,从而可以方便地评价外用药物的疗效。研究目的以卡波姆-940为基质材料制备FK506-SLN水凝胶,以温度试验、含药量及药物渗漏率为评价指标考察所制备的水凝胶的理化性质。然后,通过体外透皮扩散试验仪(Franz扩散池),以离体大鼠腹部皮肤为透皮扩散屏障进行体外透皮扩散实验,以市售他克莫司软膏为对照组,比较FK506-SLN水凝胶和市售他克莫司软膏的透皮速度、累积透皮量Q和皮肽内滞留量,初步考察FK506-SLN水凝胶的药动学性质。之后,建立小鼠耳廓皮炎模型,分别以生理盐水、市售他克莫司软膏、FK506-SLN水凝胶治疗,通过观察皮损病理变化及高倍视野下(HPF)单一核细胞数目,初步考察FK506-SLN水凝胶的药效学。方法1.采用碱法,以卡波姆-940为凝胶材料、甘油为润湿剂、三乙醇胺为中和剂,制备FK506-SLN水凝胶。2.以适量蒸馏水稀释水凝胶,磷钨酸染色后通过电镜观察FK506-SLN水凝胶中纳米粒的形态。3.肉眼评估FK506-SLN水凝胶的外观性状；以HPLC法检测药物含量,计算药物的回收率、精密度；通过温度试验,以药物含量及渗漏率为评价指标考察所制备的水凝胶的稳定性。4.制备离体大鼠腹部皮肤,并考察离体皮肤对FK506测量的影响。5.通过体外透皮扩散试验仪,以离体大鼠腹部皮肤为透皮扩散屏障进行体外透皮扩散实验,以市售他克莫司软膏为对照组,分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h间隔取样,采用HPLC法测定样品中FK506含量,通过比较FK506-SLN水凝胶和市售他克莫司软膏的透皮速度、累积透皮量Q和皮肤内药物滞留量,初步考察FK506-SLN水凝胶的药动学性质。6.采用耳肿胀法,建立小鼠耳廓皮炎模型,以生理盐水为对照,通过肉眼观察皮损状况、小鼠搔抓行为及皮损病理切片评估造模情况。7.建立小鼠耳廓皮炎模型,将模型小鼠随机分为三组,分别以生理盐水、市售他克莫司软膏、FK506-SLN水凝胶治疗5天,以痊愈、好转、无效为评价指标初步评估三种制剂的疗效；通过观察比较三组小鼠皮损病理变化及高倍视野单一核细胞数目,考察FK506-SLN水凝胶的药效学。8.将实验所得数据采用SPSS17.0统计软件进行比较分析,48小时透皮试验后所得数据及皮内药物滞留实验所得数据采用完全随机设计资料的方差分析(One-way ANOVA),重复观察所得数据采用重复测量数据的两因素多水平分析法(ANOVA),三组随机设计的资料采用完全随机设计资料的方差分析(One-way ANOVA),当P<0.05差异具有显著性。结果1.采用碱法,成功制备FK506-SLN水凝胶,其为淡蓝色半透明的半固体状制剂,外观均匀、细腻,易涂展、无油腻感。2.当流动相为乙腈-水-磷酸的体积比为70：30：1、检测波长在220nm、进样量为20μl、流速为1.0ml/min、柱温为50℃时,采用反相HPLC法测定FK506-SLN水凝胶的药物含量,方法简便可行。3.以外观性状、渗漏率及药物含量为指标评价FK506-SLN水凝胶的稳定性简便可靠,当FK506-SLN水凝胶在低温(4℃)的环境中放置30天,外观、渗漏率及药物含量均无明显变化；而置于室温(25℃)和高温(40℃)条件下,则稳定性较差。因此,FK506-SLN水凝胶适合于低温(4℃)条件下密封保存。4.选用含30%乙醇的生理盐水作为FK506-SLN水凝胶的透皮接收液,能较客观地反应FK506的透皮情况。5.结合使用研钵及超声细胞破碎仪制备透皮后皮肤乳糜液。以乙醇用为破乳剂破坏透皮后的FK506-SLN,促进药物从透皮液内的脂质体中完全释放出来,方法可行。6.体外透皮扩散试验显示,FK506-SLN水凝胶累积透过率及皮肤内药物滞留量大于市售他克莫司软膏,表明固体脂质纳米粒能显著增加药物的角质层透过量及药物在皮肤内的滞留。7.采用二硝基氟苯(DNFB)免疫攻击小鼠的方法,建立了小鼠耳廓皮炎模型,该建模方法简便,易于操作；且可通小鼠搔抓行为及小鼠耳廓皮损病理变化等指标评估造模情况。经病理证实,该模型可以部分反应人类特应性皮炎的病理变化。8.小鼠耳廓皮炎模型治疗实验表明,FK506-SLN水凝胶在改善模型小鼠耳廓皮损炎症方面的效果优于市售他克莫司软膏。结论1.以卡波姆940为基质制备的FK506-SLN水凝胶可行,所得水凝胶为淡蓝色半透明的半固体,适合于低温避光密封保存。2.体外透皮试验证明,FK506-SLN水凝胶的经皮累积渗透量、透皮吸收速率及皮肤内药物滞留量高于市售他克莫司软膏。3.经小鼠耳廓皮炎模型初步证实,FK506-SLN水凝胶在改善炎症方面的效果优于市售他克莫司软膏。