论文部分内容阅读
目的：研究发现PTH诱导的EndMT是介导CKD主动脉钙化形成的重要机制之一，而PTH诱导EndMT的机制目前仍不十分清楚。既往证据表明，PTH干预可上调EphrinB2表达，而EphrinB2/FAK信号通路参与上皮细胞间充质转分化，但EphrinB2/FAK信号通路是否参与介导EndMT尚不明确。 方法: 1．第一部分：EphrinB2对PTH诱导HAECs发生EndMT的影响。体外培养原代人主动脉内皮细胞（HAECs）：（1）分四组：1）PTH浓度为0mol/L的对照组2）PTH浓度为10-9mol/L的干预组3）PTH浓度为10-8mol/L的干预组4）PTH浓度为10-7mol/L的干预组，培养48h,real-time PCR、WB、共聚焦检测EphrinB2、EndMT相关标志物的mRNA和蛋白的表达，WB检测磷酸化EphrinB2的表达；（2）细胞分为：1）PTH+错义siRNA干预组（PTH10-7mol/L+Vehicle）2）PTH+EphrinB2siRNA干预组（PTH10-7mol/L+siRNA），培养48h，检测EndMT相关标志物的mRNA和蛋白表达。 2.第二部分：EphrinB2是否通过激活FAK信号介导PTH诱导的EndMT。（1）细胞分为四组：1）对照组（CTL组）2）PTH干预组（PTH10-7mol/L）3）PTH+错义siRNA干预组（PTH10-7mol/L+Vehicle）4）PTH+EphrinB2siRNA干预组（PTH10-7mol/L+siRNA）。培养48h，WB检测FAK及磷酸化FAK表达水平，共聚焦检测磷酸化FAK、CD31的表达。（2）细胞分为两组：1）PTH+错义siRNA干预组（PTH10-7mol/L+Vehicle）2）PTH+FAK siRNA干预组（PTH10-7mol/L+siRNA），培养48h，检测EndMT相关标志物的表达。 结果: 1.第一部分：（1）PTH干预能够呈浓度依赖性上调间充质标志物FSP1和α-SMA的mRNA及蛋白水平，同时下调内皮细胞标志物CD31和VE-Cadherin的mRNA和蛋白水平。PTH能够呈浓度依赖性上调HAECs的EphrinB2的蛋白水平及EphrinB2的磷酸化水平。共聚焦结果示：对照组（CTL组）HAECs高表达内皮细胞标志物CD31，少量表达EphrinB2；而PTH干预组HAEC变纤长，有些细胞甚至失去CD31表达，但EphrinB2表达增加。（2）与PTH+Vehi组细胞相比，PTH+EphrinB2siRNA干预组细胞的CD31和VE-CadherinmRNA和蛋白表达上调，FSP1和α-SMA的mRNA和蛋白表达水平明显降低。 2.第二部分：（1）PTH干预上调磷酸化FAK的水平，升高磷酸化FAK与FAK比值，但FAK的表达未明显改变。与PTH+Vehi组细胞相比，PTH+EphrinB2siRNA干预组HAECs的磷酸化FAK蛋白表达水平明显降低，磷酸化FAK与FAK比值亦明显降低。共聚焦示：与CTL组相比，PTH+Vehi组细胞CD31的绿色荧光强度减弱，磷酸化FAK的红色荧光强度明显增强，EphrinB2siRNA干预后，磷酸化FAK红色荧光强度较前减弱且CD31较PTH+Vehicle组增强。（2）与PTH+Vehicle组细胞相比，PTH+FAK siRNA干预组细胞的CD31、VE-Cadherin mRNA和蛋白表达水平上调，FSP1和α-SMA的mRNA和蛋白表达水平明显降低。 结论:EphrinB2/FAK信号径路参与介导PTH诱导的人主动脉内皮细胞的EndMT，应用EphrinB2siRNA或FAK siRNA抑制该信号径路的活化能够部分阻断PTH诱导的EndMT相关标志物的表达。该研究结果有助于进一步阐明PTH促进EndMT形成的机制，为临床早期防治CKD血管钙化提供了新方向，同时也为认识EphrinB2/FAK信号通路在其它方面的作用提供了思路。