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目的：急性排斥反应(acute rejection, AR)是肾移植术后的主要并发症,影响移植肾及受者的长期存活。肾小管上皮细胞(tubular epithelial cells, TEC)凋亡是移植肾急排损伤的重要病理表现,但其具体机制尚不明确。可溶性纤维介素(soluble fibrino gen-like protein2, sFGL2)是调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)分泌的效应分子,可诱导细胞凋亡从而介导组织损伤。本课题拟研究肾移植术后急排患者的血清sFGL2表达情况,分析其与外周血中促炎因子TNF-α、IFN-γ水平及Treg比例的关联,体外探索TNF-α、IFN-γ对CD4+T细胞分泌sFGL2的刺激作用及相关信号通路,并进一步探究sFGL2对TEC凋亡的影响,拟揭示sFGL2在移植肾急排中的作用,完善Treg在急排中的生物学效应,为进一步阐明移植肾急排的机制及临床防治提供理论依据。方法：收集40名于2010年11月至2011年8月在复旦大学附属中山医院接受移植肾穿刺的同种异体肾移植受者资料,采集外周血,并根据临床表现及移植肾穿刺病理证实结果分为急排组和移植肾功能稳定组(每组20名)。其中急排组根据Banff07病理分级标准进一步分为急性细胞性排斥Ⅰ级组(8名),急性细胞性排斥Ⅱ级组(6名)和急性体液性排斥组(6名)。纳入健康志愿者15名作为正常对照。利用ELISA检测血清sFGL2及TNF-α、IFN-γ水平,采用流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。从健康志愿者采集外周血,利用流式磁珠分选技术分离获得CD4+T细胞并体外培养。用不同浓度的TNF-α(62.5、125、250、500、1000U/m1)、IFN-γ(62.5、125、250、500、1000U/m1)或PBS分别刺激CD4+T细胞24、48和72小时,利用ELISA检测培养液上清sFGL2浓度,Phosflow流式细胞术检测CD4+T细胞内MAPK信号通路蛋白磷酸化水平。根据上述结果,用相关MAPK通路蛋白抑制剂干预CD4+T细胞,检测处理后的细胞培养液上清sFGL2水平的变化。此外,用10μg/ml sFGL2、10ng/ml TNF-α(阳性对照)或PBS(阴性对照)体外刺激人TEC48小时,通过Annexin V-FITC/PI染色,采用流式细胞术检测TEC凋亡情况,并利用RT-qPCR检测TEC凋亡相关基因表达情况。本研究通过复旦大学伦理委员会批准。结果：移植肾急排患者外周血sFGL2水平显著升高,且与排斥严重程度及类型相关：对比40例肾移植受者及15例健康志愿者血清sFGL2水平发现,病理证实急排的患者血清sFGL2水平(64.84±10.36ng/ml,n=20)明显高于移植肾功能稳定的患者(37.82±3.56ng/ml,n=20,p<0.05)或健康志愿者(31.25±4.08ng/ml,n=15,p<0.05),而肾功能稳定的患者与健康志愿者相比无显著差异；病理证实体液性排斥反应的患者血清sFGL2明显高于细胞性排斥反应的患者(118.80±20.28vs.41.71±4.39ng/ml,p<0.001)；在细胞性排斥反应患者中,Banff分级Ⅱ级的患者血清sF GL2明显高于Ⅰ级的患者(51.87±7.81vs.34.10±3.27]ng/ml,p<0.05)。此外,移植肾急排患者外周血促炎因子TNF-(114.90±10.20vs.67.21±8.27pg/ml,p<0.001)、IFN-γ(257.69±28.60vs.88.15±10.85pg/ml,p<0.001)水平与Treg比例(4.05±0.08vs.2.39±0.06%,p<0.001)均较肾功能稳定患者显著升高,且与sFGL2呈正相关(Spearman相关系数r分别为0.962、0.863和0.739,所有p<0.001)。在体外研究中,通过不同浓度的TNF-α、IFN-γ和PBS分别刺激CD4+T细胞,发现在1000U/ml TNF-α(0.947±0.102ng/ml)或62.5U/mlIFN-γ(0.947±0.091ng/ml)刺激48小时的条件下,CD4+T细胞分泌的sFGL2最多。此外,1000U/ml TNF-α(429.33±54.49,p<0.05)或62.5U/ml IFN-γ(520.33±36.57,p<0.01)较PBS(131.67±45.58)刺激时,CD4+T细胞中磷酸化JNK均显著增高；而p38MAPK和ERK1/2的磷酸化水平均无显著性差异。进一步研究显示,经过JNK抑制剂处理的CD4+T细胞JNK磷酸化水平明显减少(TNF-α、IFN-γ、PBS刺激分别为：280.67±0.67vs.399.67±0.33,p<0.001；350.33±0.88vs.517.33±0.33,p<0.001；95.33±1.33vs.138.33±0.67,p<0.001),而培养液上清中sFGL2水平显著降低(TNF-α、IFN-γ、PBS刺激分别为：0.550±0.081vs.0.977±0.108ng/ml,p<0.05；0.548±0.105vs.1.010±0.127ng/ml,p<0.05；0.278±0.050vs.0.514±0.054ng/ml,p<0.05)。此外,采用sFGL2体外刺激,可较PBS更显著诱导TEC凋亡(33.13±0.10vs.12.91±0.35%,p<0.001),不仅诱导早期凋亡(10.19±0.13vs.4.05±0.07%,p<0.001),亦诱导晚期凋亡(22.82±0.41vs.9.44±0.06%,p<0.001)。sFGL2诱导TEC的早期凋亡比例明显高于TNF-α(9.74±0.07%,p<0.05),而晚期凋亡比例和总凋亡比例则明显低于TNF-α(30.63±0.52%,40.34±0.24%,二者均p<0.001)。与PBS相比,sFGL2刺激后TEC中Caspase、TNF、Bcl-2、 NFKB等凋亡相关家族中促凋亡基因如CASP-3(p<0.05)、CASP-8(p<0.05)、CASP-9(p<0.05)、CASP-10(p<0.05)、TRADD (p<0.001)、 TNFSF10(p<0.01)、FADD (p<0.001)、EAS (p<0.001)、FASLG(p<0.05)、BAK1(p<0.05)、BAD (p<0.05)、BAX (p<0.001)和NF-KB1(p<0.01)均显著上调,而抑凋亡基因如CARD-18、NAIP、BCL2、IKBKB和TBKl的表达则无明显变化。结论：移植肾急排患者外周血sFGL2水平显著升高,与排斥严重程度及病理类型相关,并与外周血促炎因子TNF-α、IFN-γ水平及Treg比例升高呈正关联。在体外,TNF-α和IFN-γ通过增强MAPK信号通路中JNK磷酸化水平刺激CD4+T细胞分泌sFGL2。此外,sFGL2可诱导TEC凋亡,是通过全面上调凋亡信号通路中Caspase、TNF、Bcl-2、NFKB等凋亡相关家族中的促凋亡基因实现的,但对抑凋亡基因的表达则无明显影响。