长臀鮠(Cranoglanis bouderius)是近年来开始人工驯养的名贵经济鱼类之一。在人工养殖条件下,长臀鮠基本无病害、成活率高、养殖效益显著,但长臀鮠种苗的人工繁育技术还不成熟,长臀鮠种苗仍然依靠人工捕捞和天然水域自然繁殖。而近年来严重的水污染及过量捕捞问题,导致野生长臀鮠急剧减少,且在人工养殖过程中,长臀鮠亲鱼自然交配繁殖成功率又极低,使长臀鮠种苗来源有限,这大大限制了长臀鮠的规模化扩大生产,因此建立有效的长臀鮠人工繁殖技术显得尤为重要。目前,由于长臀鮠雌雄配子成熟不同步及其性腺发育机制不明确,使得长臀鮠规模化人工繁殖技术一直没有取得突破。因此,本实验摸索了长臀鮠精子超低温保存的适宜条件,比较了冷冻保护剂对精子保存前后激活率、快速运动时间和精子寿命的影响,检测了精子保存前后总超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、三磷酸腺苷酶(ATP)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,并且利用电镜观察了保存前后精子的形态变化。从精子运动参数、生化组成、精子结构等方面解释了超低温保存对精子结构和功能的影响,摸索出适合长臀鮠精子超低温保存的方案,以期解决长臀鮠雌雄配子成熟不同步造成的人工繁育难问题。同时,分别克隆了性腺发育相关基因SOX9和WT1基因c DNA全长,并采用实时荧光定量PCR技术测定了SOX9基因和WT1在长臀鮠不同组织的m RNA表达情况,为后续研究SOX9基因和WT1基因在控制长臀鮠性腺发育中的作用提供重要的基础数据。主要研究内容及研究结果包括以下几个方面:(1)实验通过长臀鮠亲鱼的强化获得了成熟的精巢,并获得了高活力精子。配制了5种冷冻稀释液和7种冻存液,通过设置不同保存方法,超低温保存了精子,并观察不同保护剂保存效果。结果表明,长臀鮠精子保存最佳稀释液为MPRS溶液,其精子激活率、快速运动时间和寿命最高。最佳冻存液为15%DMSO,其精子激活率、快速运动时间和寿命也最高。以MPRS溶液为精子稀释液,15%DMSO冻存液,保存长臀鮠精子效果最佳,Hank’s溶液作为精子稀释液保存效果也较好。(2)实验检测了不同保存方法对精子SOD酶、LDH酶、ATP酶、GISH-PX酶活力大小的影响。结果表明长臀鮠精子经超低温保存后其四种酶活力均显著下降,以MPRS溶液为稀释液,15%DMSO为冻存液,超低温保存长臀鮠精子,保存后四种酶活力较高,保存效果较好。(3)通过扫描电子显微镜观察了长臀鮠精子超低温保存前后精子形态,实验发现,与及保存前的精子相比,精子形态均发生不同程度的变形。主要包括头部的变形扭曲、尾部卷曲、缠绕、断裂等变化。以MPRS溶液为稀释液,15%DMSO为冻存液保存精子后精子形态较为完整。形态的损伤大小和精子保存后运动活力、酶活力大小密切相关,精子保存活力高的精子其形态也较为完整。(4)利用RACE技术获得SOX9基因和WT1基因c DNA全长,利用q PCR分析了基因在不同组织表达情况不同。在成熟雄鱼中,SOX9基因在雄性和雌性长臀鮠大脑表达含量高于其他组织含量,其次为肌肉、性腺,在肝脏、脾脏和肾脏中表达量极小。WT1基因在不同组织表达情况与SOX9基因不同。在成熟雄鱼中,精巢表达含量高于其他组织含量,其次为脾脏、心脏,在脑和肌肉中表达量极小。雌鱼WT1在心脏中表达最高,其次为脾脏,在卵巢表达极少。