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研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种慢性进展性神经病退行性疾病,随年龄增长,其发病率逐渐增加,给社会和家庭造成沉重的负担。基于以上原因,对AD的研究迫在眉睫。星形胶质细胞可通过其表面的胰岛素受体进而影响胰岛素信号转导通路,引起相应蛋白表达变化,进而影响学习记忆功能。胰岛素通过两种机制影响记忆功能：提高特定脑区如海马的葡萄糖利用,而葡萄糖可以促进记忆功能；促进神经递质如乙酰胆碱的合成,而乙酰胆碱与信息的记忆巩固密切相关。星型胶质细胞在位置上和突触前膜、突触后膜紧密相连。可通过控制神经元突触数目和效能来调节神经元的兴奋性及突触的可塑性,突触是神经元与神经元的连接部位,突触的数量和功能发生改变则引起突触可塑性的改变,进而影响学习记忆功能。学习记忆与胰岛素信号转导通路和突触相关蛋白密切相关。我们前期研究表明,星型胶质细胞存在胰岛素信号转导通路,且经过Aβ1-42寡聚体作用后,胰岛素信号转导通路相关蛋白表达发生变化。侧脑室注射Aβ1-42寡聚体的模型动物存在行为学改变,且海马区胰岛素信号转导通路相关蛋白的表达亦存在异常。APP17肽是可溶性p-淀粉样肽前体蛋白(soluble amyloid precursor protein, SAPP-α)的活性片段,具有神经营养作用。它通过调节神经元存活信号转导通路和神经营养因子的表达,同时抑制凋亡相关因子的表达,从而改善神经系统超微结构的损害,提高动物学习记忆能力。APP17肽位于APP695第319-335位肽段,其中328-332位精氨酸-谷氨酸-精氨酸-蛋氨酸-丝氨酸(RERMS)的5肽是保持此活性的关键序列。APP17肽虽然具有明显的神经元保护作用,但需要皮下注射给药,如果进行临床实验,患者难以长期坚持。与胰岛素和APP17肽相比,经首都医科大学宣武医院多肽室自行设计、并结构改造的APP5肽类似物P165可以抵抗消化酶的酶解作用,口服有效,有利于临床上长期应用,也是其进一步开发利用的最大优势所在。以往的实验研究根据MTT代谢率和细胞计数得到量效曲线,得出其最佳药物浓度。P165可以改善1型糖尿病小鼠的学习记忆功能,上调抗凋亡蛋白的表达,对腹腔注射STZ、侧脑室注射STZ拟痴呆模型动物的行为学、胰岛素信号转导通路蛋白的表达有明显改善作用。研究目的观察APP5肽类似物P165对Aβ1-42寡聚体作用的星型胶质细胞胰岛素信号转导相关蛋白的影响,观察星型胶质细胞是否存在突触后致密区相关蛋白,APP5肽类似物P165对Ap1-42寡聚体作用的星型胶质细胞突触后致密区相关蛋白的影响。观察APP5肽类似物P165对侧脑室注射Aβ1-42寡聚体模型动物胰岛素信号转导蛋白及突触相关蛋白的影响,进一步明确P165的作用机理。研究方法1.细胞分组：将星型胶质细胞分为4组,C组为空白对照组,给予无胎牛血清的DMEM,Aβ组为给予1umolLAβ1-42寡聚体溶液,两者在5%C02、37℃细胞培养箱中培养24小时。Aβ+I组、Aβ+P组为在Aβ组的基础上,即给予1umolLAβ1-42寡聚体溶液培养24小时后分别给予胰岛素100nmol,APP5肽类似物P165 40umol/L作用30分钟。2.观察星型胶质细胞胰岛素信号转导通路相关蛋白的变化。通过Western-blot检测胰岛素信号转导通路蛋白变化及胰岛素、P165对相关蛋白表达的影响。3.观察星型胶质细胞突触后致密区相关蛋白的变化。通过Western-blot检测突触后致密区相关蛋白变化及胰岛素、P165对相关蛋白表达的影响。。4.动物分组：昆明小鼠,雄性,60只,体重22±3g,随机分为3组,每组20只,即正常对照组(C组)、AD模型组(AD组)、P165治疗组(AD+P165组)。C组行手术不给予药物治疗,AD组给予侧脑室微量泵泵人Aβ1-42寡聚体,每天注射2uL,APP5肽类似物P165灌胃,剂量20μg/只/天,C组和AD组以等体积生理盐水灌胃。连用4周。5.用Morris水迷宫实验检测小鼠行为学改变。分析记录小鼠到达平台的时间,在空间分析探索实验时小鼠经过平台所在位置的次数。6.应用免疫组织化学染色和Western-blot的技术方法,检测小鼠海马胰岛素信号转导通路蛋白IR、IRS-1、Akt、PI3K和突触蛋白PSD-95、Shank1的表达变化及P165对以上蛋白的影响。7.统计学方法。采用SPSS17.0进行统计学分析,单因素方差分析,数据以x±SD表示,p<0.05认为差异有统计学意义,p<0.01认为差异有显著统计学意义。研究结果1.观察APP5肽类似物P165对拟痴呆模型星型胶质细胞胰岛素信号转导通路相关蛋白的影响。Western-blot结果显示与C组相比,经Aβ1-42寡聚体作用后,IR、IRS-1、PI3K、 Akt均降低(分别为p<0.05,p<0.01,p<0.01,p<0.01),P165能使其表达增加(均为p<0.05),且与胰岛素治疗组相比,无明显差异(p>0.05)。2.观察APP5肽类似物P165对拟痴呆模型星型胶质细胞突触相关蛋白的影响。Western-blot结果显示与C组相比,经Aβ1-42寡聚体作用后,PSD-95、Shank1(分别为p<0.05,p<0.01),P165能使其表达增加(均为p<0.05),且与胰岛素治疗组相比,无明显差异(p>0.05)。3.水迷宫实验：(1)AD组小鼠逃避潜伏期比C组明显延长(P<0.01),而P165治疗组潜伏期较AD组缩短(p<0.05)。(2)AD组小鼠寻找平台时间较C明显延长(p<0.01),P165治疗组较AD组缩短(p<0.05)。4.观察APP5肽类似物P165对拟痴呆模型小鼠胰岛素信号转导通路相关蛋白的影响。(1)免疫组织化学染色结果显示与C组相比,AD小鼠海马IR阳性神经元表达下降(p<0.01),而P165可使其升高(p<0.01)。Western-blot结果显示与C组相比,AD组小鼠海马IR表达下降(p<0.01),P165可使其升高(p<0.01)。(2)免疫组织化学染色结果显示与C组相比,AD组小鼠海马IRS-1阳性神经元表达下降(p<0.01),P165可使其表达增加(p<0.01)；Western-blot结果显示与C组相比,AD组小鼠海马IRS-1阳性神经元表达下降(p<0.01),APP5肽类似物P165可使其升高(p<0.01)。(3)免疫组织化学染色结果显示与C组相比,AD小鼠海马Akt阳性神经元表达下降(p<0.05),而P165可使其升高(p<0.05)。Western-blot结果显示与C组相比,AD组小鼠海马Akt阳性神经元表达下降(p<0.05),P165可增加Akt的表达(p<0.05)。(4)免疫组织化学染色结果显示与C组相比,AD小鼠海马PI3K阳性神经元表达下降(p<0.01),而P165可使其升高(分别为p<0.05)；Western-blot结果显示与C组相比,AD组小鼠海马PI3K阳性神经元表达下降(p<0.01),而P165可使其升高(p<0.05)。5.观察APP5肽类似物P165对拟痴呆模型小鼠突触相关蛋白的影响。(1)免疫组织化学染色结果显示与C组相比,AD小鼠海马PSD-95阳性神经元表达下降(p<0.01),P165可使其升高(p<0.05),Western-blot结果显示与C组相比,AD组小鼠海马PSD-95阳性神经元表达下降(p<0.05),而P165可使其升高(p<0.05)。(2)免疫组织化学染色结果显示与C组相比,AD小鼠海马Shank1阳性神经元表达下降(p<0.05),而P165可使其升高(p<0.05)。Western-blot结果显示与C组相比,AD组小鼠海马Shank1阳性神经元表达下降(p<0.05),P165可使其升高(p<0.05)。研究结论1.APP5肽类似物P165可改善Aβ1-42寡聚体诱发AD模型胰岛素信号转导通路相关蛋白的表达。2.APP5肽类似物P165可双向调节胰岛素信号转导通路相关蛋白的表达。3.星型胶质细胞存在突触相关蛋白,且Aβ1-42寡聚体可使突触相关蛋白表达下降。4.APP5肽类似物P165可改善Aβ1-42寡聚体诱发AD模型突触相关蛋白的表达。5.胰岛素可改善Aβ1-42寡聚体诱发AD模型突触相关蛋白的表达。