大鼠骨髓间充质干细胞旁分泌HGF并下调Rho通路促进肝星状细胞凋亡

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目的探讨在体外实验大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与肝星状细胞(HSCs)共培养体系中BMSCs旁分泌HGF对肝星状细胞凋亡的影响及对Rho通路的调控。方法实验分4组:①空白对照组:单纯肝星状细胞;②实验组:a.对照组:HSCs与BMSCs共培养组;b. HGF抑制剂组:c-Met阻滞剂PHA665752以3μg/ml干预HSCs与BMSCs共培养体系;c. Rho通路抑制剂组:Rho通路抑制剂Y-27632以30μmol/l干预HSCs与BMSCs共培养体系。用半透膜(transwell insert)建立上下双层细胞共培养体系,各组均培养24h、48h及72h,于倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化;免疫细胞化学法观察α-肌动蛋白(α-SMA)的表达情况;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测加入Rho通路抑制剂Y-27632及c-Met阻滞剂PHA665752的最佳干预浓度;用流式细胞仪检测HSCs的凋亡率;Western Blot、Q-PCR检测肝星状细胞RhoA蛋白及mRNA的表达情况;酶联免疫吸附法(ELISA法)检测各组细胞上清液中HGF及HGFA的质量浓度。结果①倒置相差显微镜下观察,可见状态良好的BMSCs胞体大,折光性好,呈典型的长梭形;状态良好的HSCs呈膜状生长,呈典型的星形或多边形,胞内较多颗粒。②培养48h的HSCs胞浆可见棕黄色颗粒,细胞核染成淡蓝色,显示α-肌动蛋白(+),94%以上活化的HSCs呈阳性。③实验组随着时间的延长HSCs凋亡率逐渐增高,实验b组凋亡率最低,实验c组凋亡率最高,均以72h最为显著,各组在各时段凋亡率差异有统计学意义(P<0.05);④实验c组RhoA蛋白及mRNA表达量较其他各组明显下降,差异有统计学意义(P<0.01),各组RhoA蛋白及mRNA表达量随时间的延长而逐渐增加(P<0.01);⑤实验各组HGF浓度随时间延长逐渐降低,实验b、c组较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.05);实验各组HGFA浓度随时间延长逐渐增高,实验b组升高最为明显,差异有统计学意义(P<0.01);⑥PHA665752、Y-27632浓度分别为3μg/ml、30μmol/L时,HSCs凋亡最明显,其增值抑制率最高,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论在BMSCs与HSCs共培养体系中,HGFA激活了BMSCs旁分泌的HGF,并通过下调Rho通路促进肝星状细胞凋亡。
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