地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是存在于多种生境的革兰氏阳性生防细菌,它的生防抑菌机制主要是通过分泌各种天然活性产物,来抑制多种细菌、真菌及其病原体,而羊毛硫肽类抗菌肽是其中重要的一类天然产物。近年来,随着高通量测序技术的快速发展,基于大量的微生物菌株中基因组的数据挖掘显示,地衣芽孢杆菌在合成多种新颖的羊毛硫肽类抗菌肽方面,其潜力远超以往的认知。本研究基于已发表的地衣芽孢杆菌菌株中基因组数据和生物信息学工具,采用基因组挖掘方法分析和鉴定出新型潜在的羊毛硫肽生物合成基因簇。针对地衣芽孢杆菌中编码新型羊毛硫肽基因簇中的基因进行克隆和异源表达,结合质谱数据分析异源表达产物的结构,并对其生物活性进行了研究。1、截止2019年3月,以已发表的74株地衣芽孢杆菌为对象,采用GGDC计算地衣芽孢杆菌之间的DDH值,辅以重新构建系统发育关系,对地衣芽孢杆菌进行分类。推测菌株LMG-6934、LMG-7559以及127185不属于真正的地衣芽孢杆菌,应划分为新物种。采用在线软件anti SMASH 4.0,我们从74株地衣芽孢杆菌中挖掘出9类768个次级代谢产物合成基因簇,其中有399个潜在未知的次级代谢产物基因簇。利用anti SMASH 4.0、BAGEL 3等生物信息平台对18株基因组完全测序的地衣芽孢杆菌进行挖掘和分析,发现共存在107个18种羊毛硫肽前体肽,并且都属于第二类羊毛硫肽,其中菌株SCDB34中存在两种潜在新型羊毛硫肽前体肽Lic A3和Lic A4。2、对地衣芽孢杆菌中挖掘出3种羊毛硫肽前体肽、2种合成酶以及1种肽酶结构域基因进行基因克隆和载体构建。采用热激转化法获得3种前体肽表达菌株;通过将前体肽、合成酶和肽酶结构域分别进行组合利用热激转化法获得6种合成羊毛硫肽的共表达菌株。对前体肽表达菌株进行异源表达,Tricine-SDS-PAGE鉴定结果显示,表达产物的分子量与生物信息学软件预测值几乎相同,表明前体肽Lic A1、Lic A3和Lic A4异源表达成功。为得到修饰后成熟的羊毛硫肽,借助解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）WS-8中的酶修饰前体肽。对体外酶促反应产物采用HPLC分析并结合抑菌活性检测结果,发现3种前体肽Lic A1、Lic A3和Lic A4均未被解淀粉芽孢杆菌WS-8中的酶所修饰,未有羊毛硫肽产生,可能由于菌株WS-8中不存在3种前体肽特异性的羊毛硫肽合成酶。3、对6种共表达菌株1AT、1BT、3AT、3BT、4AT和4BT进行异源表达,HPLC检测异源表达产物,发现只有共表达菌株3BT在液相峰图18-36 min出现明显的差异峰。通过改变共表达菌株的异源表达条件,尝试异源表达出可能产羊毛硫肽的5种共表达菌株,检测结果显示5种共表达菌株表达失败,表明只有羊毛硫肽前体肽Lic A3能被合成酶Lic MB修饰加工,有成熟的羊毛硫肽产生。为了进一步确定3BT表达产物的活性,采用半制备HPLC对其进行分离和纯化,对峙结果表明3BT的表达产物具有抗真菌和细菌的活性。基于羊毛硫肽前体肽Lic A3氨基酸序列信息为指导结合质谱数据对3BT表达产物进行鉴定,发现前导肽在修饰过程中存在3种水解方式,推测核心肽经过4次脱水和4次环化脱去8个水分子形成有活性的羊毛硫肽。