背景：　　 病态窦房结综合征（简称病窦，sick sinus syndrome，SSS）是临床难治性重大心血管疾病，主要表现为持续的缓慢性心律失常，重者发生心跳骤停，严重威胁患者生命。目前尚无有效根治SSS措施，西药治疗以阿托品、肾上腺素等药物提高心率为主，但副作用大，患者难以坚持长期服药;严重者需植入人工心脏起搏器，而起搏器价格昂贵、寿命短，需定期更换，且易导致感染、导丝断裂、起搏器综合征等并发症。中医药治疗SSS从整体入手，通过多种作用环节缓解SSS患者临床症状，提高患者的生活质量和生存率，延长寿命。　　 窦房结是心脏自律性的发源地，其起搏功能的正常对维持心脏正常的泵血功能尤为重要。窦房结起搏细胞的自发性动作电位保证了窦房结自律性的稳定，其动作电位的形成有赖于窦房结细胞膜上各种离子流综合作用的结果，因此任何一种离子通道结构与功能的异常均可导致窦房结起搏功能异常，从而引发SSS。　　 强心复脉方(QFR)是全国著名老中医刘志明从医70余年总结治疗SSS的有效原创方。前期大量临床与基础研究表明该方疗效肯定，可有效改善SSS患者临床症状，提高心率，改善窦房结自律性和传导功能，改善窦房结组织细胞结构和功能，从整体、组织、分子、基因等不同水平揭示强心复脉方治疗SSS的机制，但尚未从离子通道学水平对其细胞电生理机制进行研究。　　 目的：　　 在探索适合于细胞电生理学研究的乳鼠窦房结细胞(SNC)分离方法基础上，成功分离出适合于进行全细胞膜片钳研究的乳鼠SNC，进一步探讨QFR含药血清对乳鼠受损窦房结细胞动作电位(AP)相关参数及复极相关电流(Ito和IKur)的影响，以揭示QFR治疗SSS的细胞电生理机制，为名老中医经验方治疗病窦提供科学依据，为中药研究的思路提供借鉴。　　 方法：　　 1.以常规培养法(“酶解+差速贴壁+5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)”)作为对照，探索一种适合于细胞电生理学研究的乳鼠SNC分离方法，即“酶解+差速贴壁”法。　　 2.将采用“酶解+差速贴壁”法分离的乳鼠SNC分为正常组、模型组、100 ul、200 ul、300 ul强心复脉含药血清组及100 ul空白血清组，除正常组，其余各组细胞均模拟缺血-再灌注(I-R)法制备乳鼠SNC损伤模型，并利用全细胞膜片钳技术观察空白血清及强心复脉方含药血清对各组SNC自发性搏动频率、作电位时程APD20、A PD50、APD90、最大舒张电位(MDP)、动作电位幅值(APA)的影响。　　 3.将采用“酶解+差速贴壁”法分离的乳鼠SNC分为正常组、模型组、100 ul、200 ul、300 ul强心复脉含药血清组及100 ul空白血清组，除正常组，其余各组细胞模拟I-R法制备SNC损伤模型，并利用全细胞膜片钳技术观察空白血清及强心复脉方含药血清对各组SNC瞬时外向钾电流（Ito）和超速激活延迟整流钾电流(IKur)电流-电压曲线及相关门控机制的影响。　　 结果　　 1.“酶解+差速贴壁”组与常规培养组分离的乳鼠窦房结细胞中，镜下均可观察到三种形态:梭形、三角形、多边形，且均为梭形细胞比例最高，分别为(58.0±3.0)％和（63.6±1.7）％，但两组差别无统计学意义。对“酶解+差速贴壁”组细胞的搏动频率进行统计，结果显示，梭形细胞和三角形细胞的搏动频率分别为（104.4±4.6）次/min和（61.1±1.47）次/min，且梭形细胞搏动频率较三角形细胞快(P＜0.01)，多边形细胞无搏动。对两组中梭形细胞进行全细胞膜片钳实验发现，均可记录到自发性动作电位(AP)及超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道电流（If），符合窦房结起搏细胞特性。与常规培养组比较，“酶解+差速贴壁”组细胞边缘较整齐，纹理较清晰，细胞膜的弹性较好，立体感较强。“酶解+差速贴壁”组和常规培养组进行膜片钳实验破膜成功率分别为65％和45％。　　 2.与正常组比较，模拟I-R造模后SNC的自发性搏动频率减慢，APD20由(21.6±5.4）ms延长至（77.2±5.5）ms，APD50由（76.7±4.8）ms延长至（147.5±5.1）ms，均具有极显著统计学差异(P＜0.01)，APD90虽有延长，但无统计学意义。加入100ul强心复脉方含药血清后，窦房结细胞自发性搏动频率加快，分别于造模后细胞外液加入100ul、200ul、300ul强心复脉方含药血清后，APD20分别缩短至（35.7±7.1）ms、（50.1±7.5）ms、（39.7±4.3）ms，差别具有统计学意义(P＜0.01)，三组之间无统计学差异;APD50分别缩短至（90.6±5.8）ms、(111.0±4.1)ms、（109.0±2.4）ms，差别具有统计学意义(P＜0.01)，其中100 ul含药血清组缩短较200 ul、300 ul含药血清组更明显(P＜0.05)，但200 ul和300 ul含药血清组之间无差异;APD90的改变无统计学意义。100 ul空白血清对造模后SNC的APD20、APD50和APD90均无明显改变。　　 3.与正常组比较，模拟I-R造模后SNC最大舒张电位(MDP)由（-61.9±5.4）mV变为（-54.5±4.6）mV，动作电位幅值(APA)则由（84.7±5.0）mV降至（71.4±4.7）mV，均具有显著性统计学差异(P＜0.01)。分别于造模后细胞外液加入100 ul、200 ul、300 ul强心复脉方含药血清后，各组MDP均无明显改变，100 ul和300 ul含药血清分别使APA升高至（83.2±5.9）mV和(82.2±6.4)mV，具有显著性统计学差异（P＜0.01），但两组间比较无统计学意义，200 ul含药血清对造模后SNC的APA虽有升高，但无统计学差异。100 ul空白血清对造模后SNC的MDP及APA均无明显影响。　　 4.正常组SNC的Ito和Ikur峰值电流密度分别为（23.08±2.52）pA/pF和(21.7±2.5) pA/pF，模拟I-R造模后细胞Ito和IKur峰值电流密度分别降为（14.06±1.23）pA/pF和（14.4±0.9）pA/pF，均具有极显著性差异(P＜0.01)。分别于造模后细胞外液加入100 ul、200 ul、300 ul含药血清后，Ito峰值电流密度分别升高至(18.97±1.96) pA/pF、(20.95±1.12) pA/pF、(21.65±1.73) pA/pF(P＜0.01),三组之间比较，峰值电流密度虽然随着给药浓度增加而增加，但无统计学差异;IKur峰值电流密度分别增大至（17.69±1.92）pA/pF、（18.74±2.03）pA/pF、(20.00±1.57)pA/pF(P＜0.01)，三组之间比较，峰值电流密度虽然随着给药浓度增加而增加，但无统计学差异。空白血清组与模型组SNC比较，Ito和IKur峰值电流密度无统计学差异。分别于正常SNC外液加入100 ul强心复脉方含药血清及空白血清后，含药血清组细胞Ito和IKur峰值电流密度均较正常组有所升高(P＜0.05)，空白血清组细胞Ito和IKur则无明显变化。　　 各组Ito和IKur的电流-电压(I-V)曲线图显示，SNC的Ito和IKur电流随着电压向去极化移动，电流密度均增大，且均呈现一定的外向整流特征。模拟I-R造模后，Ito和IKur在各电压下电流密度均有降低，但电流-电压曲线形状基本不变，Ito在+20 mV以上的电压范围内， IKur在+10 mV～+70 mV的范围内，电流密度降低值有统计学差异（P＜0.05）。于造模后细胞外液中加入100 ul强心复脉方含药血清后，各电压下电流密度均有不同程度升高，Ito在+10 mV～+70mV范围内及IKur在+20 mV～+70 mV的范围内，I-V曲线恢复尤其明显(P＜0.05)。与模型组比较，100ul空白血清组细胞Ito和IKur各电压下电流密度均无明显变化。于正常SNC外液分别加入100ul含药血清和空白血清后，含药血清组Ito和IKur各电压下电流密度均明显升高，Ito在+10mV～+70mV范围内有统计学差异(P＜0.05)，IKur在+20mV～+70mV的范围内有统计学差异(P＜0.05)，而空白血清组Ito和IKur各电压下电流密度均无明显改变。　　 与正常组比较，模拟I-R造模后SNC的Ito和IKur稳态激活曲线均右移，即向去极化方向移动，半激活电压(V1/2)Ito从正常组的（-8.64±2.25）mV移至（13.14±0.97）mV（P＜0.01），IKur从正常组的（-13.6±1.1）mV移至(-10.34±1.57)mV(P＞0.05)。加入100 ul强心复脉方含药血清后，稳态激活曲线均左移，Ito和IKur的V1/2分别变为（-3.28±1.66）mV和（-21.71±2.65）mV，与模型组比较差别具有统计学意义(P＜0.01)。Ito和IKur的激活曲线斜率K分别由正常的（11.66±1.93）mV和（9.84±1.11）mV变为造模后的（12.10±0.95）mV(P＞0.05)和（17.60±2.01）mV(P＜0.01)，加入100 ul强心复脉方含药血清后，分别变为（10.67±1.43）mV和(15.02±2.13) mV，但差别均无统计学意义。　　 与正常组比较，模拟I-R造模后SNC的Ito和IKur稳态失活曲线均左移，V1/2分别从（-39.54±0.61）mV和(-49.17±4.11) mV变为(-53.93±0.89) mV(P＜0.01)和(-66.67±8.11)mV（P＜0.01），加入100ul强心复脉方含药血清后，稳态失活曲线均右移，V1/2分别变为(-37.33±2.19) mV和（-30.54±4.81）mV，与模型组比较差别均具有统计学意义(P＜0.01)。失活曲线斜率K分别由正常的(8.14±0.54) mV和(9.02±1.02) mV变为造模后的(9.91±0.82) mV和(13.24±1.08) mV，加入100 ul强心复脉方含药血清后，分别变为（11.96±2.14）mV和(12.26±0.57) mV，但差别均无统计学意义。　　 与正常组比较，模拟I-R造模后SNC的Ito通道失活后恢复曲线无明显差异，IKur通道失活后恢复减慢，在前3000 ms表现的尤为突出，加入100 ul含药血清后，Ito曲线无明显改变，IKur曲线略有恢复，但未恢复到正常范围。　　 结论：　　 1.与常规培养法相比，“酶解+差速贴壁”法可成功分离出乳鼠SNC，符合SNC结构和电生理特性，该方法操作步骤简单，细胞损伤小、活性好，更适合用于细胞电生理学研究，该方法分离的乳鼠SNC为梭形，具有自发性搏动，可记录到自发性动作电位(AP)及超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道电流（If）。　　 2.强心复脉方含药血清可加快乳鼠受损SNC自发性搏动频率，缩短作电位时程APD20、APD50，而对APD90无明显影响，可增大乳鼠受损SNC的APA，同时可保护乳鼠受损SNC形态结构，从而提高心率。　　 3.强心复脉方含药血清能电压依赖性增大正常及受损乳鼠SNC的Ito和IKur电流密度;加快Ito和IKur通道稳态激活，减慢Ito和IKur通道稳态失活，双重作用以恢复降低的Ito和IKur电流密度，以缩短SNC动作电位的复极，从而提高其自律性;对Ito通道失活后恢复无明显影响;对IKur通道失活后恢复略有影响。强心复脉方可能是通过上述机制增强SNC复极电流Ito和IKur以缩短动作电位时程，改善SNC起搏功能，从而加快心率。