【摘 要】
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生物被膜是细菌在生物或非生物表面聚集形成的膜状结构,可以增强细菌对不利环境的耐受性。沙门菌是一种常见的、重要的食源性致病菌,在自然环境中常以生物被膜的形式存在。抗生素在生产及应用中常形成不同的浓度梯度,这可能导致细菌暴露在亚抑制浓度（sub-MICs）中,从而使细菌发生一系列适应性变化。本实验室前期研究结果表明,1/8 MIC头孢噻肟（CTX）可以诱导沙门菌SH16SP46株生物被膜形成能力增强,
【基金项目】
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国家自然科学基金,项目名称:亚抑制浓度头孢噻肟增强沙门菌生物被膜形成机制研究,项目编号:31872495；
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生物被膜是细菌在生物或非生物表面聚集形成的膜状结构,可以增强细菌对不利环境的耐受性。沙门菌是一种常见的、重要的食源性致病菌,在自然环境中常以生物被膜的形式存在。抗生素在生产及应用中常形成不同的浓度梯度,这可能导致细菌暴露在亚抑制浓度（sub-MICs）中,从而使细菌发生一系列适应性变化。本实验室前期研究结果表明,1/8 MIC头孢噻肟（CTX）可以诱导沙门菌SH16SP46株生物被膜形成能力增强,根据转录组结果以及CTX的作用机制,本研究选择了差异表达基因ail及三种青霉素结合蛋白（PBP）编码基因进行研究,利用Red同源重组技术构建沙门菌基因缺失突变株,测定其生物被膜形成能力、细菌形态、生长特性、细胞膜通透性等表型,探讨相应基因在介导CTX诱导增强沙门菌生物被膜形成中的作用。主要研究结果如下:1.ail基因在介导CTX诱导增强沙门菌生物被膜形成中的作用以沙门菌SH16SP46株为亲本株构建了ail基因缺失突变株（Δail）。生物被膜形成能力结果表明,无CTX诱导时野生株（WT）和Δail生物被膜形成能力无显著差异（P＞0.05）,1/8 MIC CTX诱导时WT和Δail生物被膜形成能力均显著增强（P＜0.05）,但Δail生物被膜形成能力显著低于WT（P＜0.01）;生长曲线结果表明,ail基因缺失不影响细菌的生长;微孔板黏附能力测定结果表明,在1/8 MIC CTX作用下,Δail菌株黏附能力显著低于WT（P＜0.001）;细胞膜通透性和细菌自凝率实验结果显示,ail基因缺失并不影响细菌的细胞膜通透性和细菌之间的凝集;革兰氏染色结果显示,ail基因缺失后并不影响细菌形态。当ail基因回补后可一定程度提高Δail的黏附能力及生物被膜形成能力。2.PBP编码基因在介导CTX诱导增强沙门菌生物被膜形成中的作用以沙门菌SH16SP46株为亲本株,分别构建了PBP1a、PBP1b、PBP3编码基因缺失株Δmrc A、ΔmrcB、Δfts I。1/8 MIC CTX诱导不同菌株时,Δfts I、Δmrc A生物被膜形成能力均显著增强（P＜0.001）,而ΔmrcB生物被膜形成能力未见明显增强（P＞0.05）。对ΔmrcB作进一步研究:生长曲线结果表明,mrcB基因缺失不影响细菌的生长;无论是否存在CTX诱导,ΔmrcB细胞膜通透性和自凝率与WT相比均无显著差异（P＞0.05）;SEM和革兰氏染色结果均显示,在1/8 MIC CTX作用下,WT形态从短杆状态变成长丝状,而ΔmrcB形态未发生明显变化。当mrcB基因回补后CTX诱导增强生物被膜形成能力以及长丝状形态变化得到恢复。3.其他头孢类药物诱导增强沙门菌生物被膜形成机制的初步探讨为探究其他头孢类药物在亚抑制浓度下对沙门菌是否也存在生物被膜诱导增强的现象以及参与作用的PBP类型,选取4种头孢类药物进行研究。亚抑制浓度药物诱导生物被膜形成试验表明,1/4 MIC头孢喹肟及1/8 MIC头孢吡肟可诱导WT生物被膜形成增强,而头孢噻呋及头孢他啶不存在诱导增强的现象;革兰氏染色观察,WT在头孢喹肟、头孢吡肟、头孢他啶作用下均呈长丝状变化,而头孢噻呋作用下保持短杆状。在1/8 MIC头孢吡肟的作用下,mrcB缺失后失去诱导生物被膜形成增强能力和长丝状形态变化,当mrcB基因回补后诱导增强生物被膜形成能力以及长丝状形态变化得到恢复。在1/4 MIC头孢喹肟的作用下,Δmrc A生物被膜形成能力未见明显增强,但细菌形态呈长丝状变化。总而言之,本研究结果表明,ail基因有助于增强沙门菌黏附能力和生物被膜形成,而mrcB基因编码的PBP1b是头孢噻肟和头孢吡肟的主要作用靶点,介导两种药物诱导下的细菌长丝状形态变化和生物被膜形成能力的增强,头孢喹肟存在不同于头孢噻肟的作用靶点和机制。
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