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目的:
1.动态观察FHF大鼠肝组织Smac/DIABLO及caspase3 mRNA表达情况。
2.动态观察FHF大鼠肝功能指标、大鼠肝组织免疫组化情况及生存率。
3.制备暴发性肝衰竭(Fulminant hepamic failure,FHF)大鼠模型。
方法:
1.将雄性成年SD大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)制备FHF模型,正常对照组注射同等体积的生理盐水。
2.分别在造模后的12h、24h、48h、72h、120h、168h、240h动态观察血清肝功能生化指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)及白蛋白的变化。
3.用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Smac/DIABLO及caspase3 mRNA的表达。三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作内参对照,半定量分析Smac/GAPDH、caspase3/GAPDtH灰度比值。
4.留取肝组织用免疫组织化学方法(SABC法)检测Smac/DIABLO及caspase3蛋白的表达,每张切片随机选取5-10个高倍镜视野(×400),计算每1000个肝细胞中阳性细胞数,为Smac/DIABLO及caspase3标记指数(labeling index,LI),即LI=阳性细胞数/1000×100%。
5.取12只正常大鼠的血清及肝组织检测以上指标作为正常对照。
6.同时取15只大鼠行生存率分析。
结果:
1.肝衰竭模型建立后ALT、AST、TBil迅速升高,并于48h达高峰,造模后白蛋白呈下降趋势,并于48h时达低谷,随后逐步回升。
2.FHF大鼠肝组织中Smac/DIABLO及caspase3 mRNA及免疫组化的表达较正常组明显增加(P<0.05),在造模后的第72h表达最高。
3.D-GalN制备FHF模型后大鼠生存率约为40%左右。
结论:
1.腹腔注射D-GalN的肝衰竭造模成功,大鼠状态、死亡率、肝脏组织学及生化学改变符合FHF。
2.Smac/DIABLO及caspase3 mRNA及免疫组化的表达随着FHF的进程而波动,可以较好地判断FHF肝细胞的凋亡情况,有利于FHF预后的判断,如何适当抑制Smac/DIABLO在caspase系统反应中的作用为肝功能衰竭治疗提供了新的思路。