人诱导多功能干细胞的建立及其定向肝细胞的分化和移植免疫的基础研究

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第一部分 人原代肝细胞的分离培养与鉴定目的:通过对目前可行的组织灌流分离肝细胞的方法进行优化改良,以获得更高产量和活性的肝细胞。鉴定分离培养的原代肝细胞是否可以在体外环境中维持肝细胞的特异表型,并发挥肝细胞的部分功能。方法:通过研究目前已有的人肝细胞组织分离方法,在灌流法的基础上通过在分离过程中调整分离使用的酶组合和浓度,灌流途径和时间,离心条件等,比较分析从肝脏组织中分离获得的原代肝细胞的产量和细胞活性,推演出肝细胞组织分离的高效方案。通过对分离的原代肝细胞进行体外培养和其生长状态的连续观察,并采用细胞免疫荧光染色技术检测分离细胞中肝细胞的特异蛋白ALB、AFP和ASGPR1的表达水平,以及比较分析药物作用前后CYP450的活性变化,评估体外培养的人原代肝细胞是否具备良好的肝细胞表型和一定的肝细胞功能。结果:通过改良优化的灌流法,可成功从人肝脏组织中分离出原代肝细胞,细胞产量可达(20-50)×106个/g湿重,且细胞活性稳定在90%以上。通过体外连续培养及观察,显示分离培养的原代细胞具备肝细胞的特有形态并可维持4-7天左右。通过对分离培养细胞进行肝细胞特异蛋白ALB、AFP和ASGPR1免疫荧光染色,显示分离培养的肝细胞表面高表达蛋白ALB和ASGPR1,而低表达AFP,证明该改良技术分离培养的肝细胞与成肝细胞的表型相似。此外,通过对体外培养的人肝细胞进行CYP450药物诱导,显示所获得的人肝细胞可在体外环境中发挥较高的药物代谢活性,同时也进一步证明了该分离培养技术可获得较高质量的肝细胞。结论:通过调整目前已有的肝细胞组织分离方案,成功从人肝脏组织中更高效地分离出高质量的肝细胞。原代肝细胞可在体外环境中培养一定的时间,维持成肝细胞的相似细胞表型,并发挥肝细胞相关的药物代谢功能。第二部分 人皮肤成纤维细胞来源诱导多功能干细胞的建立及鉴定目的:探讨研究携带OCT3/4,SOX2,KLF4,L-MYC,LIN28和p53短发卡RNA(shRNA)的附加型载体转染的非整合技术在重编程人皮肤成纤维细胞为诱导多功能干细胞(iPSCs)中的可能性及其效率。方法:在体外通过酶消化的方法从人的皮肤组织中分离成纤维细胞并培养,通过检测Vimentin蛋白表达鉴定成纤维细胞。提取纯化携带有eGFP,OCT3/4,SOX2,KLF4,L-MYC,LIN28和p53 shRNA的附加型质粒,并通过核转染的方式将其一同转入分离培养的人皮肤成纤维细胞中,通过观察荧光显微镜下eGFP的表达水平评估转染效率。在iPSCs的培养条件下,每日观察重编程细胞的生长状态并换液,当出现类似iPSCs的集落形成时对其进行显微挑选并继续扩增培养。通过碱性磷酸酶染色,及细胞免疫荧光染色和RT-PCR技术,鉴定建立的iPSCs系中多能干细胞标记蛋白NANOG、OCT3/4、SOX2、SSEA-4 和 TRA-1-60,多潜能基因 OCT3/4 与 NANOG 的表达。此外,通过畸胎瘤形成实验,观察建立的人iPSCs系在体内是否可向三个胚层的方向分化,确定其多能性。结果:通过酶消化的方法,从人皮肤组织中分离的细胞经体外培养呈现出成纤维细胞的细胞形态并高表达Vimentin蛋白。通过核转染技术成功将提取纯化的附加型质粒转入人成纤维细胞中,次日GFP的表达水平可稳定达20%-30%左右。通过连续观察,在重编程后的第28天左右可在光镜下发现iPSCs的细胞集落形成,挑选扩增的细胞呈现出iPSCs的细胞形态和生长状态。经碱性磷酸酶染色检测发现,重编程细胞均显示蓝色阳性表达,且细胞免疫荧光和RT-PCR实验表明,重编程细胞中可高表达NANOG、OCT3/4、SOX2、SSEA-4 和 TRA-1-60 蛋白和 OCT3/4 与 NANOG 多潜能基因。此外,重编程的人iPSCs系经皮下注射可在小鼠的体内形成瘤样组织,并通过组织学分析可见瘤内分别出现了三个胚层来源的衍生组织。结论:人成纤维细胞可从皮肤组织中进行体外分离和扩增培养。通过核转染的方式可成功将携带有OCT3/4,SOX2,KLF4,L-MYC,LIN28和p53 shRNA的附加型质粒转入人皮肤来源的成纤维细胞,并高效地重编程成形似iPSCs的细胞。此外,建立的iPSCs系在体外一系列的实验中显示出iPSCs特异的细胞表型,且体内实验也证实重编程细胞具备高效的多能性状态。第三部分人诱导多功能干细胞定向肝脏细胞分化和移植的研究目的:探讨研究一种更为简单、省时和高效的人诱导多能干细胞(iPSCs)定向肝细胞分化的可行性方案,并比较优化此过程中影响诱导效率的可能性因素。此外,分析研究iPSCs衍生肝细胞与组织原代肝细胞之间的差异,进一步指导iPSCs定向肝细胞分化的研究并明确iPSCs衍生肝细胞的细胞学特征及应用。方法:综合目前已有的iPSCs定向肝细胞的诱导方案,通过在诱导的起始状态、诱导细胞因子应用及浓度、诱导各阶段的时间等诱导条件上进行比较调整,分析各阶段终点的特异性标记分子,推演总结可获得高质量iPSCs衍生的肝细胞的方案。通过RT-PCR技术鉴定iPSCs衍生的肝细胞中干细胞多潜能基因和肝细胞特异基因的表达水平,细胞免疫荧光染色技术检测iPSCs衍生的肝细胞中肝细胞特异蛋白ALB、ASGPR1和AFP的表达程度,而且通过ELISA方法定量分析iPSCs衍生的肝细胞中ALB蛋白的分泌能力。然后,在体外环境中通过药物诱导观察iPSCs衍生的肝细胞中CYP450的代谢活性。此外,通过小鼠肝部分切除模型及细胞移植技术,观察人ALB蛋白在移植小鼠体内的表达情况,评估iPSCs衍生肝细胞是否可以在小鼠肝脏中归巢、增殖并在一定程度上发挥肝细胞的功能。结果:通过对iPSCs定向肝细胞诱导方案的比对比分析,发现在开始诱导前细胞汇合度达20%左右时,第一阶段诱导终点的细胞可稳定表达90%以上的内胚层特异性蛋白SOX17。第二阶段中的HGF因子浓度在20ng/mL与更高浓度使用无明显差异,此阶段终点细胞开始出现肝细胞的形态学变化,也可稳定表达约80%的肝细胞特异性蛋白HNF4α。诱导获得的肝细胞样细胞经RT-PCR检测证实几乎完全失去了干细胞多潜能基因OCT3/4和NANOG,另外出现了不同程度的肝细胞特异性基因的表达,例如ASGPR1、TAT、CYP3A4和CYP7A1等。通过细胞免疫荧光染色技术可见,iPSCs衍生的肝细胞的细胞中可表达ALB、ASGPR1和AFP蛋白,说明衍生肝细胞接近于肝细胞的成熟状态,而且经ELISA证实此衍生肝细胞还具备了 ALB蛋白的分泌功能,其表达水平接近于组织分离的人原代肝细胞的70%。此外,通过此方案iPSCs衍生的肝细胞在注射入肝部分切除的Retrosine预处理组小鼠脾脏内后,在小鼠血清和肝脏内检测到人ALB蛋白的表达。结论:通过对iPSCs定向肝细胞分化过程中时间、试剂和设备等方面的改良,iPSCs可高效地分化为肝细胞样细胞,且体内和体外均可具备与原代肝细胞相似的一些细胞表型和肝细胞功能,但其诱导效率和生物安全性还需进一步探讨。第四部分调控BATF的表达对同种异体移植急性排斥反应的影响目的:研究探讨碱性亮氨拉链转录因子ATF-like(BATF)对同种异体移植急性排斥反应的影响及其可能机制。方法:在小鼠腹腔异位心脏移植模型的基础上,通过将BALB/c(H2d)小鼠的心脏移植入C57BL/6(B6,H2b)小鼠的腹腔中构建急性排斥反应模型。体外构建BATF shRNA载体并筛选鉴定其干扰效率。将移植手术后小鼠分为三组:BATF shRNA、Negative shRNA和Control组,并进行相应处理。通过每日触摸心脏搏动情况判断移植心脏的存活和组织学检查急性排斥反应的发生及其程度。通过流式细胞学分析技术检测各组小鼠脾脏内Th1、Th17和Treg细胞的表达比例,并采用RT-PCR和ELISA技术分析炎性细胞特异性转录因子和细胞因子的表达和分泌情况。结果:在小鼠腹腔异位心脏移植技术基础上成功构建了同种异体移植急性排斥反应的动物模型。体外成功构建了 BATF shRNA的表达载体,并筛选出高效干扰的BATF shRNA。通过移植前尾静脉注射BATF shRNA,同种异体移植的心脏可在shBATF作用下延长搏动约3-5天,心脏组织HE染色分析显示BATF shRNA组小鼠移植物内的炎性细胞浸润明显降低。此外,小鼠脾脏淋巴细胞经流式细胞学检测发现Th1细胞亚群的表达比例无显著差异,而Th17和Treg细胞的表达比例分别出现降低和升高,具有统计学差异。RT-PCR和ELISA的检测结果也表明上述炎性细胞相应的转录因子和细胞因子也出现了相似表达趋势。另外,BATF shRNA组小鼠血清中细胞因子IL-4的分泌水平出现了显著降低。结论:BATF的表达干扰可在一定程度上延长同种异体移植物的存活并减弱急性移植排斥反应的发生程度,其发生机制可能涉及Th 17和Treg细胞轴偏移以及IL-4分泌水平降低有关。
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