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跨膜型TNF-α (Transmembrane tumor necrosis factor, tmTNF-α)是分泌型TNF-α (Secreted TNF-α, sTNF-α)前体,在TNF-α转换酶处理后,释放其胞外端而成为sTNF-α。两型TNF-α均具有生物学功能。sTNF-α是典型的促炎细胞因子,在急性肝衰和内毒素性休克发病机制中扮演着关键作用；然而,tmTNF-α在这两种疾病中的作用虽然有转基因动物的实验报道,但转染的是缺失酶切位点的tmTNF-α突变体。我们的前期工作证实该突变体与野生型分子在信号转导上有明显差异,且不同实验室报道结果相反。鉴于这些报道可能不能反映天然tmTNF-α在这2种疾病中的作用,本研究旨在观察内源性tmTNF-α对急性鼠肝衰及内毒素性休克的影响,并探索其作用机制。主要结果如下：第一部分跨模型TNF-α对急性肝衰的影响一、肝组织损伤变化特点给小鼠注射LPS/D-gal制备急性肝衰模型,HE染色结果显示,注射后2h可见肝细胞呈轻度水肿,4h肝细胞水肿,并有少量灶状坏死,6h可见肝窦淤血,肝细胞坏死,肝细胞索断裂；血清ALT和AST直至LPS/D-gal处理后6h才显著升高,提示这个时间点肝组织明显受损。二、急性肝衰内源性sTNF-α与tmTNF-α表达的变化与肝组织损伤的相关性1. sTNF-α变化特点：ELISA结果显示LPS/D-gal注射后2h小鼠血清sTNF-α达峰值,随着时间延长而降低,4h后几乎消失；从LPS/D-gal处理2h小鼠分离的KCs培养上清sTNF-α含量最高,而4h与6h分离的KCs培养上清sTNF-α虽然明显降低,但仍然显著高于正常鼠分离的KCs培养上清,提示循环中sTNF-α不能代表炎症局部sTNF-α的变化。2. tmTNF-α表达变化：用FCM分析急性肝衰小鼠KCs和PMs细胞表面tmTNF-α表达的变化,结果显示在LPS/D-gal处理后2h及4h tmTNF-α呈低表达,而在6htmTNF-α表达显著上升。3.两型TNF-α与血清转氨酶关系：急性肝衰小鼠血清TNF-α变化与血清转氨酶AST及ALT变化相反,而KCs和PMs表达tmTNF-α水平与肝组织是否放至血清ALT或AST的量呈正相关,提示是tmTNF-α而不是sTNF-α与急性肝组织损伤相关。三、 KCs-6h与PMs-6h分泌促炎和抑炎因子失衡1.血清促炎因子IL-6与抑炎因子IL-10的比值变化：用ELISA证实急性肝衰小鼠血清IL-6显著升高,其在4h达高峰,在6h则有所降低,为高峰水平的87.8%；而血清IL-10含量则在2h最高,随后下降,其在6h的水平仅为高峰水平的23.6%。计算IL-6与IL-10比值,发现其在6h才显著增加,与肝组织损伤变化一致,提示血清IL-6/IL-10比值增加可更好的预测急性肝损伤。2.高表达tmTNF-α的KCs-6h和PMs-6h分泌促炎和抑炎因子失衡：将LPS/D-gal注射后不同时间分离的KCs和PMs在体外进行培养,结果显示这两种巨噬细胞培养上清IL-6与IL-10的变化与血清变化一致；IL-6/IL-10比值在急性肝衰6h显著增加,与此时间点这2种巨噬细胞高表达tmTNF-α呈正相关；提示在LPS/D-gal处理6h分离的KCs (KCs-6h)和PMs (PMs-6h)分泌促炎和抑炎因子严重失衡,进而加重肝脏的炎性损伤。四、高表达tmTNF-α的KCs-6h诱导肝细胞凋亡1-KCs-6h通过直接接触诱导肝细胞凋亡：将肝细胞与来自LPS/D-gal处理2h或6h的KCs进行共培养,结果显示,高表达tmTNF-α的KCs-6h细胞可通过直接接触诱导肝细胞凋亡增加,导致培养上清AST升高；而低表达tmTNF-α的KCs-2h细胞则无此效应；当用Transwell膜将KCs-6h细胞与肝细胞隔离培养后,无肝细胞出现凋亡。2. KCs-6h细胞通过tmTNF-α直接诱导肝细胞凋亡：当用TNF-α抗体预处理KCs-6h细胞30min,以中和其表达的tmTNF-α,再与肝细胞共培养,肝细胞凋亡显著降低,提示KCs-6h细胞表达的tmTNF-α可直接诱导肝细胞凋亡。3.高表达tmTNF-α的KCs-6h细胞表达FasL增加：尽管用抗体中和tmTNF-α可显著降低肝细胞凋亡,但仍有部分凋亡细胞,提示其它凋亡途径可能参与了KCs-6h诱导肝细胞凋亡。Real time PCR和Western blotting的结果显示高表达tmTNF-α的KCs-6h细胞表达FasL基因及其蛋白明显高于低表达tmTNF-α的KCs-2h细胞,提示tmTNF-α可能通过增加FasL表达而促进肝细胞凋亡。五、过继KCs-6h细胞可加重LPS/D-gal诱导小鼠肝组织损伤1. KCs-6h细胞可持续表达tmTNF-α:为了保证过继有效性,我们首先检查KCs-6h细胞tmTNF-α表达是否稳定。结果显示：连续培养KCs-6h细胞至6天,其表达tmTNF-α仍能维持原有水平；2.过继KCs-6h细胞加重肝组织损伤：HE结果显示：与LPS/D-gal组相比,过继KCs-6h细胞可明显加重小鼠在LPS/D-gal处理4h的肝组织损伤,表现为肝窦淤血,肝细胞索断裂,水样变性及少量坏死。3.过继KCs-6h促进肝细胞凋亡：肝组织切片TUNEL染色显示,过继KCs-6h细胞明显促进肝细胞凋亡,血清AST也显著高于过继KCs-2h的小鼠,提示高表达tmTNF-α的KCs-6h在体内可以加重LPS/D-gal诱导的肝衰。4.过继KCs-6h增加血清IL-6/IL-10比值：ELISA结果显示过继KCs-6h细胞导致血清促炎因子IL-6和IL-1β含量明显高于过继KCs-2h组小鼠,而抑炎因子IL-10低于KCs-2h组小鼠,IL-6/IL-10比值明显增加,提示高表达tmTNF-α的KCs-6h分泌促炎和抑炎因子平衡障碍,从而参与急性肝衰的发生发展。第二部分跨模型TNF-α对内毒素性休克的影响一、特异性tmTNF Ab的制备与鉴定：1.tmTNFAb的制备与鉴定：针对tmTNF-α单表位成功制备了兔抗小鼠tmTNF-α抗体。ELISA显示兔血清含有高效价抗tmTNF-α单表位抗体,且只结合tmTNF-α肽段,不与sTNF-α发生交叉反应。2. tmTNF Ab可与细胞表面tmTNF-α结合：用FCM证实该抗体可与TNF-α+NH3T3细胞表面tmTNF-α结合,而不能与TNF-α阴性的CT26与H22细胞株结合,提示该抗体可识别细胞表面完整的tmTNF-α分子。二、tmTNF Ab可有效阻断tmTNF-α转换为sTNF-α:1. tmTNF Ab阻断tmTNF-α转换为sTNF-α:用100ng/ml LPS和tmTNF Ab分别刺激RAW264.7巨噬细胞系和PMs原代细胞4h, ELISA和FCM结果显示该抗体可有效抑制sTNF-α分泌,而显著增加tmTNF-α的表达,提示该抗体可有效阻断tmTNF-α转换为sTNF-α。2. tmTNF Ab抑制LPS诱导RAW264.7上清sTNF-α胞毒效应：用生物活性证实LPS刺激RAW264.74h的上清对TNF-α敏感靶细胞L929具有明显胞毒效应,用TNF-α抗体预先中和上清sTNF-α后,可阻断其胞毒效应；用tmTNF Ab明显抑制LPS刺激RAW264.7上清的胞毒效应,再次证实tmTNF Ab抑制1tmTNF-α酶解,致使sTNF-α分泌减少,因而其胞毒效应受到抑制。四、tmTNF Ab对LPS诱导巨噬细胞产生促炎和抑炎因子的影响1. tmTNF Ab抑制LPS诱导巨噬细胞产生NO：用LPS和tmTNF Ab刺激RAW264.7和PMs,结果显示该抗体可明显抑制LPS诱导这2种巨噬细胞转录iNOS基因以及分泌NO。2. tmTNF Ab抑制LPS诱导巨噬细胞产生促炎因子IL-6和IL-1β：用LPS和tmTNF Ab刺激RAW264.7和PMs,结果显示该抗体可明显抑制LPS诱导这2种巨噬细胞转录IL-6和IL-1p基因及分泌这些细胞因子。3. tmTNF Ab对LPS诱导巨噬细胞产生抑炎因子IL-10无影响：用LPS和tmTNFAb刺激RAW264.7和PMs,结果显示该抗体对LPS诱导这2种巨噬细胞转录IL-10基因及其表达无影响。五、tmTNF Ab保护小鼠抵抗内毒素血症1. tmTNF Ab可阻断内毒素血症小鼠tmTNF-α转变为sTNF-α:预先给予tmTNF-α Ab明显增强LPS注射小鼠4h腹腔巨噬细胞的tmTNF-α表达,同时抑制该时间点内毒素血症小鼠血清TNF-α含量(P<0.01),提示tmTNF Ab在体内可有效阻断tmTNF-α转换成sTNF-α。2. tmTNF Ab可改善内毒素性休克临床症状,提高小鼠存活率：用tmTNF Ab可明显减轻内毒素性休克鼠唇紫绀,改善临床评分,显著提高内毒素血症小鼠的存活率。3. tmTNF Ab抑制内毒素血症促炎因子分泌：LPS注射小鼠2h血清促炎因子IL-6、IL-1p及NO以及抑炎因子IL-10即开始升高,6h达高峰,此后下降。用tmTNF Ab可明显降低内毒素血症小鼠上述血清促炎因子的水平,却轻度增加IL-10含量,但无统计学意义。综上所述,tmTNF-α在不同的病理状态下发挥不同的、甚至相反的作用。在LPS/D-gal诱导的急性鼠肝衰中KCs和PMs表达的tmTNF-α可直接诱导肝细胞凋亡以及通过分泌促炎/抗炎因子失衡加重肝脏的炎性损伤。反之,用tmTNF Ab促进tmTNF-α表达,抑制sTNF-α分泌,在体外可抑制巨噬细胞对LPS的应答,在体内保护小鼠抵抗内毒素性休克。该研究不但证实tmTNF-α在不同疾病中的作用,还为治疗TNF相关疾病提供新的策略和线索。