目的一、研究羟基乙酸乙基纤维素微球的制备方法及其体外释放特征。二、评价羟基乙酸乙基纤维素微球对兔VX2肝肿瘤的介入治疗作用。材料和方法一、羟基乙酸乙基纤维素微球的制备及检测（一）制备工艺的确定以羟基乙酸作为药物，乙基纤维素作为大分子包裹材料，采用溶剂蒸发法制备羟基乙酸乙基纤维素微球。（二）优化设计制备条件在一定范围内羟基乙酸的浓度及乙基纤维素的量是影响微球颗粒粒径大小及其均匀度的主要因素。考察不同条件下制备微球的外观、粒径、载药量及包封率，优化微球制备条件。（三）载药量和包封率的测定精密称取羟基乙酸乙基纤维素微球冻干粉末100mg，置于10ml离心管中，加二氯甲烷2ml，水浴超声15min溶解，加蒸馏水2ml萃取，离心（869×g）5min，上层水溶液用滴管移至10ml容量瓶中，萃取5次后定容。利用标准曲线方程，计算微球的载药量和包封率。载药量＝含药量/微球总量×100%；包封率＝实际载药量/理论载药量×100%。（四）微球粒径分布及测定取微球于激光粒度分析仪，测量微球的粒径分布。（五）微球的形态观察取适量干燥羟基乙酸乙基纤维素微球，用导电胶带粘连固定于样本台，喷金后在扫描电镜下观察微球形态。（六）微球的体外释放特征测定称取微球适量，置于离心管内，加入PH7.4PBS，放入台式水浴恒温振荡器中，置温度37±0.5℃，转速100rpm.在设定时间点离心取上清溶液，用高效液相色谱仪，于220nm处测定吸光度，按高效液相色谱测定释药量，计算累计释药百分率。二、羟基乙酸乙基纤维素微球介入治疗兔肝肿瘤的研究（一）实验动物新西兰大白兔30只，由第二军医大学动物中心提供，体重2.5-3.5kg,雌雄不限。制备肝脏肿瘤模型。（二）动物模型建立VX2肿瘤经新西兰大白兔肝脏内种植传代，取肿瘤已长到3～4cm直径的种兔，以1.5%戊巴比妥1.5ml/kg经耳缘静脉麻醉后固定，消毒铺巾，将肿块整体剥离取出，生理盐水漂洗，切取鱼肉样肿瘤组织数块放入小烧杯中，加入少量生理盐水，眼科剪反复剪切使肿瘤组织块成1mm见方的组织块备用。经耳缘静脉将种植兔麻醉后，仰卧位固定于兔台，常规腹部脱毛、消毒，取腹正中切口，进腹后轻轻拉出肝脏，将含有VX2瘤块注入肝实质内，轻压迫创面止血后将肝脏送回腹腔，关腹。术后连续3天肌肉注射青霉素（5000u/只）。2周后进行介入治疗。（三）实验分组兔VX2肝肿瘤模型30只，因介入治疗的效果受肿瘤体积因素的影响，植瘤后13d（即行TACE前1天）行CT检查，计算荷瘤兔肿瘤体积，将其按肿瘤体积随机分为3组，经右侧股动脉插管至肝动脉，行造影后向肿瘤供血动脉给药：A组羟基乙酸-乙基纤维素微球组（n=10），注入羟基乙酸乙基纤维素微球混悬液1ml（0.02g/ml）;B组碘油组(n=10)，注入碘油1ml；C组生理盐水对(n=10)，注入生理盐水1ml。（四）动物模型的介入治疗操作介入治疗时间选择在接种后2周，模拟人肝动脉插管介入治疗方法进行。以1.5%戊巴比妥1.5ml/kg经耳缘静脉麻醉后固定，切开皮肤，暴露分离右股动脉，穿刺置入3F微导丝和微导管。用导丝在T12和L1椎体水平腹主动脉前壁寻找腹腔干动脉开口，导管跟导丝入腹腔动脉后“冒烟”，证实后造影（总量2ml，速率0.5ml/s）。造影明确肿瘤血管及染色后超选肝动脉给药。由于兔肝动脉细小，在插管超选肿瘤供血动脉过程中，部分实验兔血管受到导管刺激后，容易诱发痉挛，这时需稍稍撤出导管，注入利多卡因0.5-1ml后再进行介入操作。术中轻柔操作，减少对血管壁的刺激是减少血管痉挛，减少术后死亡率，提高手术成功的关键。（五）结果观察①介入治疗前及介入治疗后1周行心脏取血化验肝功，观察各组肿瘤兔肝功变化；②介入治疗前（V1）及治疗后1周(V7)分别行肝脏螺旋CT扫描，测量瘤灶大小，按公式计算肿瘤体积[V=ab2／2(V为估计体积，a为肿瘤最大径，b为肿瘤最小径)]，按公式（V7/V11）计算介入治疗前后的各组肿瘤体积比计算肿瘤生长率(growthrotes，GR);③介入治疗后2周各组随机挑选5只以观察生存时间，以治疗后次日起观察生存天数，并以生理盐水组为对照计算生命延长率(％)。生命延长率(％)=(治疗组平均存活天数／生理盐水组平均存活天数-1)×100%。④其余动物均予处死，切取肿瘤组织最大面，避开坏死组织过多的部分，厚约2～3mm，移植瘤组织以10%中性缓冲甲醛液固定，石蜡包埋切片4μm，HE染色，免疫组化采用EnVisionPlus染色系统。（六）统计学分析_数据表示为(x±s)(范围)，采用SPSS11.0统计软件包分析处理数据，组间测量资料以方差分析进行分析，方差齐性时以LSD-test进行组间的两两比较，方差不齐时以Game-Howell test进行组间的两两比较，P<0.05认为有统计学意义。结果一、羟基乙酸乙基纤维素微球的制备工艺为：乙基纤维素0.18g，溶于2ml二氯甲烷中，涡旋3分钟混合均匀，作为油相；配置0.04112g/ml的羟基乙酸水溶液作为内水相；取400ul内水相注入油相中，以400W功率超声3分钟，形成W/O初乳；外水相为含有浓度为0.04112g/ml的1%PVA；在900rpm下将初乳用注射器匀速注入20ml外水相中，搅拌10分钟制得W/O/W复乳；之后降低搅拌速度到400rpm搅拌4小时挥发二氯甲烷；微球混悬液离心、洗涤、冻干后得干燥微球。二、羟基乙酸乙基纤维素微球外观光滑，球形圆整，平均粒径为233.38±1.62um。微球载药量106ug/mg，包封率74%。三、羟基乙酸乙基纤维素微球体外释放有突释现象，在2h处释放了40.75%,后期缓释效果良好，可释药72小时以上。四、实验分组A组肿瘤体积平均为(2.00cm3±0.87)（0.71-3.21cm3）,B组肿瘤体积平均为(2.28cm3±1.15)（1.33-4.66cm3），C组肿瘤体积平均为(1.95cm3±0.70)（1.00-2.91cm3），组间肿瘤体积大小比较无显著统计学意义(F=0.39,P=.68，ANOVA)。五、介入术前各项指标在3组之间均无统计学差异。对介入治疗前后各指标的差值比较，发现ALB在各组之间并无统计学差异；对于肝酶ALT，A组、B组较C组具有明显统计学意义（分别为P=.037, P=.007, Game-Howell test）；对于肝酶AST,A组与C组相较有明显统计学意义（P=.011,Game-Howell test）。A组肿瘤生长率远低于B组和C组(分别为P=.022, P=.001, Game-Howell test)。A组生存时间较B、C组明显延长。病理H-E染色中A组及B组均可见肿瘤纤维组织包膜明显增厚，癌巢中央大片坏死，癌细胞排列松散，细胞核明显固缩，病理性核分裂明显减少。A组的VEGF表达和PCNA增殖活性显著弱于B组。结论一、羟基乙酸乙基纤维素微球外观光滑，球形圆整，平均粒径为233.38±1.62μm。微球载药量106μg/mg，包封率74%。体外释放药物可达72小时以上，具有良好的缓释功能。二、羟基乙酸乙基纤维素微球对VX2兔肝肿瘤有良好的治疗效果，使用安全。