第一部分星形细胞经由TGF-β诱导胶质瘤血管拟态形成及其机制研究研究背景胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是中枢神经系统中最常见且最致命的原发性肿瘤。其快速增殖及广泛浸润的生长特点为外科手术治疗带来了极大的困难。由于肿瘤的增殖和侵袭均需要诱导大量的血管生成来为其提供必要的营养支持,因而应用抗血管生成药物治疗胶质瘤的潜力倍受瞩目。然而,近期的研究结果表明尽管抗血管生成药物可以在一定程度上抑制胶质瘤的进展,但对于胶质瘤患者的总生存期并无明显的改善作用。更令人担忧的是,抗血管治疗甚至可能增强胶质瘤在缺血缺氧条件下的适应性进而增强肿瘤的侵袭能力。1999年肿瘤血管拟态的概念被提出,研究者发现肿瘤内部除正常血管外还存在一种特殊结构由肿瘤细胞代替正常血管内皮细胞以供血浆及血细胞从中通过,从而为快速增殖进展的肿瘤提供必要的营养支持。目前肿瘤血管拟态结构已被发现于包括胶质瘤在内的多种肿瘤当中,并且其阳性率与肿瘤的进展程度密切相关。因而,肿瘤血管拟态在肿瘤内的广泛存在可能是导致抗血管治疗失效的重要原因。所以在对胶质瘤病人进行抗血管治疗的同时,抗肿瘤血管拟态的药物也应当被合并应用。然而目前关于这种药物的研究并不多见。在颅内,胶质瘤所导致的缺血缺氧环境会不断募集周围的星形细胞及小胶质细胞。因而人们可以经常在胶质瘤及颅内转移瘤的周围发现活化的星形细胞的存在。尽管星形细胞的基本功能是保护神经元细胞,然而对于胶质瘤,星形细胞也具有可以通过旁分泌的途径激活胶质瘤增殖的有关基因同时增强胶质瘤的耐药性。除此之外瘤旁的星形细胞也可以通过旁分泌的方式促进肿瘤细胞多种原癌基因的表达,从而促进胶质瘤的增殖,迁移及侵袭能力的增加。而在星形细胞分泌的众多细胞因子当中,TGF-β因其对肿瘤进展的重要作用而备受瞩目。Galunisertib(LY2157299)是一种ATP的类似物同时也是TGF-βRI的一种特异性阻断剂,作为仅有的几种TGF-β的抑制剂药物,其正在进行的临床IV期实验显示其对胶质瘤预后具有较好的改善效果。然而目前关于其具体的作用机制仍需要进一步的讨论同时该药物与星形细胞之间的关系也需要进一步的研究。从而为其将来进一步的应用打下坚实的基础。研究目的胶质瘤作为一种致死率较高的肿瘤,其极强的侵袭性及浸润生长的特点为外科手术治疗带来了极大的难度。目前关于胶质瘤的研究认为颅内血管拟态水平与胶质瘤预后有直接相关关系。因而本研究主要集中探讨了星形细胞是否经由TGF-β2调节胶质瘤肿瘤血管拟态形成,及由此产生的生物学及临床意义。研究方法和结果1.人星形细胞可以促进胶质瘤细胞系形成肿瘤血管拟态通过免疫组化(IHC)明确星形细胞在胶质瘤中的分布,通过Brdu增殖实验及Transwell侵袭实验明确了星形细胞对胶质瘤侵袭及增殖的作用,通过添加基质胶及应用Transwell、室,构建星形细胞／胶质瘤共培养模型及体外VM形成实验,研究结果显示：星形细胞能够明确地诱导胶质瘤细胞形成肿瘤血管拟态。2.星形细胞诱导胶质瘤细胞肿瘤血管拟态形成依赖TGF-β1的分泌而Galunisertib可抑制该作用。通过向星形细胞／胶质瘤共培养模型中加入贝伐单抗,我们发现抑制VEGF通路对肿瘤血管拟态的形成并没有起到显著的抑制作用,通过应用悬浮芯片筛查,我们发现TGF-β1的表达量在星形细胞与胶质瘤共培养后显著增高,而同时RT-PCR, ELISA的结果也验证了我们这一结论,之后我们通过向胶质瘤细胞系中添加外源性TGF-β1及TGF-β1的抑制剂证明了,星形细胞通过分泌TGF-β1的方式诱导了胶质瘤细胞系肿瘤血管拟态的形成,而Western blot的结果也验证了TGF-β1的来源。在明确星形细胞诱导胶质瘤肿瘤血管拟态形成的作用后,我们尝试在星形细胞/胶质瘤共培养模型中应用贝伐单抗来抑制这一作用,然而结果并不理想。为了探明星形细胞影响胶质瘤肿瘤血管拟态形成的具体机制,我们应用悬浮芯片技术对共培养模型的上清进行了筛选,通过对200多种细胞因子的筛查,我们发现TGF-β的表达在共培养模型中有显著的上升,而也有相关的文献报道TGF-β可能参与了肿瘤血管的发育形成。之后我们应用RT-PCR及ELISA的技术对上一结论进行了验证,明确了TGF-β表达水平在共培养后的变化。通过将外源性TGF-β因子加入到胶质瘤细胞系当中,我们发现能够得到与星形细胞/胶质瘤共培养类似的结果。而在向共培养模型中添加了TGF-β的抑制剂Galunisertib后,肿瘤则无法有效的形成血管拟态。结合Western blot的结果,我们认为来源于星形细胞的TGF-β参与了胶质瘤肿瘤血管拟态的形成并在其中发挥了重要的作用。3. Galunisertib可以经由Akt, Flk抑制、E-cadherin及SMa的表达。首先通过Western blot我们发现星形细胞可以显著增加胶质瘤细胞表达肿瘤血管拟态的相关标志物VE-cadherin、SMαβMMP2及MMP9,而Galunisertib可以显著抑制这些标志物的表达。同时Western blot也显示星形细胞诱导胶质瘤肿瘤血管拟态这一过程中伴随着Akt及Flk信号通路的变化及细胞自噬水平的改变,而之后我们通过免疫荧光对VE-cadherin及SMa进行了验证,也得到了相似的结果。在明确信号通路的改变后,我们应用相关信号通路的抑制剂对Akt及Flk通路进行了体外成管实验及Western blot验证,并得到了相应的结果。4. Galunisertib可抑制胶质瘤自噬进而影响胶质瘤肿瘤拟态的形成通过Western blot我们发现胶质瘤自噬的标志物LC3B及P62在添加TGF-β刺激后及加入Galunisertib后均发生了显著改变。而同时根据我们对转染GFP-LC3B慢病毒后的胶质瘤细胞进行定量统计发现,自噬阳性细胞的比率也显著增加。另通过自噬检验的金标准透射电镜,结果也显示：TGF-β可促进胶质瘤自噬水平的增强而Galunisertib则起到抑制作用。细胞的自噬水平一直与其能量代谢水平紧密相连,因而我们通过借助Seahorse XFe24能量代谢分析仪发现,共培养后的胶质瘤细胞其能量代谢水平显著增加,而加入Galunisertib后期代谢水平则呈较低水平。而体外的成管实验也证明,通过抑制自噬可以抑制胶质瘤细胞肿瘤血管拟态的形成。5. Galunisertib在体外荷瘤模型中抑制了肿瘤的生长和肿瘤血管拟态的形成我们首先在NOD-SCID小鼠皮下接种了约1x107的胶质瘤细胞,之后定期测量肿瘤的直径及小鼠的体重,并在约5周左右时统一处死。对取得的皮下肿瘤体积及重量进行定量分析,同时进行石蜡包埋并进行免疫组化分析,利用CD34/PAS双染统计肿瘤血管拟态的阳性率。研究结果显示：Galunisertib在体外荷瘤模型中抑制了肿瘤的生长和肿瘤血管拟态的形成。结论1.星形胶质细胞能够促进胶质瘤细胞形成肿瘤血管拟态。2.星形胶纸细胞主要通过分泌TGF-β的方式诱导胶质瘤形成肿瘤血管拟态而Galunisertib能够抑制这一过程的产生。3. Galunisertib抑制了VE-cadherin, SMa等肿瘤血管拟态标志物的表达从而抑制了肿瘤血管拟态的产生而该过程主要经由Akt,Flk信号通路。4. Galunisertib可抑制胶质瘤自噬进而影响胶质瘤肿瘤拟态的形成。5.通过抑制自噬可以抑制肿瘤的代谢活动进而影响肿瘤血管拟态形成。第二部分TGF-β经由自噬对胶质瘤侵袭的影响及其机制研究研究背景恶性脑肿瘤基于其极强的增殖能力、侵袭能力及化疗抗性因而被看作是最难治疗的肿瘤之一。尽管目前针对肿瘤的原癌基因及血管生成等机制为靶点已经开发了多种药物,然而并没有显著地改善胶质瘤患者的生存期。因而人们目前仍然急切地需要加深对胶质瘤成瘤机制的认知。越来越多的研究显示,肿瘤微环境尤其是多种多样的细胞因子诱导了肿瘤的恶性生物学行为的产生。而其中’TGF-β被报道与胶质瘤的侵袭能力密切相关,目前的临床证据显示,约有95%的胶质瘤患者在病程的晚期可以检测到明显的TGF-β表达水平升高,而除此之外-TGF-β也与肿瘤上皮间充的转化密切相关,而这一过程往往提示了肿瘤侵袭能力的增强。目前自噬作为肿瘤的研究热点,其在胶质瘤中的作用也被人越来越关注。目前的研究表明,自噬可以影响胶质瘤的侵袭能力,胶质瘤的能量代谢水平及胶质瘤的P53原癌基因的表达。目前有研究认为TGF-β可以增强肝癌细胞中的自噬水平而这一过程与肝癌细胞的增殖能力密切相关。而关于TGF-β关于自噬影响胶质瘤侵袭的具体机制尚未见报道。因此在本研究中我们集中探讨了TGF-β与自噬的关系并。研究目的本研究的主要目的在于通过分析TGF-β对胶质瘤自噬水平的影响,进而揭示该过程的生物学意义及对胶质瘤发生的影响。通过深入分析自噬影响胶质瘤侵袭机制的原因,从而为胶质瘤的临床治疗提供新的理论支持。研究方法和结果1.TGF-β及LC3B在人胶质瘤中均高度表达并呈明显的相关关系且与胶质瘤患者的预后有关通过对不同等级胶质瘤切片进行IHC染色并应用Pearson法进行关联性分析,我们发现TGF-β及LC3B随肿瘤等级升高表达明显增加且存在一定的正相关关系,同时我们也进行了免疫荧光的共定位分析及原代肿瘤地RG--PCR分析,并得到了类似的结论。之后我们通过对历年55例病例进行统计学分析,认为TGF-β及LC3B的高表达显著影响病人的预后。2.TGF-β以时间依赖及剂量依赖的方式调控胶质瘤细胞的自噬水平通过对三种不同的胶质瘤细胞系U251,T98,U87进行Wlestern blot分析,我们发现随着TGF-β浓度的不断提高,胶质瘤细胞系的自噬水平也不断升高(LC3B),而这一过程在加入TGF-β后的24小时达到高峰。而通过转染GFP-LC3B慢病毒及透射电镜,我们可以得到类似的结论。而在加入了自噬的抑制剂3-MA及Baf后,我们发现TGF-β诱导的自噬可能是发生于非：mTOR依赖的途径,同时相关的Microarray分析也发现了自噬相关基因的变化。3.TGF-β诱导的自噬参与了胶质瘤细胞的侵袭过程然而对胶质瘤的增殖并不产生影响。通过Western blot我们首先对即将应用的siATG5,siATG7质粒的干扰效率进行验证,之后通过Brdu增殖实验,我们发现干扰自噬后,对TGF-β诱导的胶质瘤细胞增殖并无明显影响。而之后通过划痕及Transwell侵袭实验,我们发现干扰自噬后,可以显著影响TGF-β诱导的侵袭能力增强,因而我们认为,TG-—β诱导自噬这一过程主要在胶质瘤侵袭中发挥作用。4.抑制自噬可抑制-TGF-β诱导的MMP及EMT标志物的表达通过对三种胶质瘤细胞系13种不同MMP蛋白的RT-PCR结果分析,我们发现TGF-β能够显著促进MMP转录水平的表达而自噬抑制剂Baf可以抑制这一现象。通过MMP2,MMP9的ELISA分析,我们也可以得到类似的结论。之后我们利用Western blot对EMT的标志物也进行了验证,发现抑制自噬也同样可以抑制TGF-β诱导EMT转化,而通过对N-cadherin及Vimentin的免疫荧光检验,我们也可以发现相同的结论。5.TGF-β经由自噬调控了肿瘤细胞的能力代谢重排首先通过应用Mitotracker对胶质瘤的线粒体进行染色,我们发现TGF-β可以诱导肿瘤细胞线粒体的融合,而在应用Baf后该过程被阻断。同时,通过对标记线粒体的位置进行分析,我们发现TGF-β同样对线粒体在肿瘤细胞内的位置分布产生了影响,而自噬参与了这一过程。之后我们通过、Vestern blot对线粒体融合过程中Mfn1/2,OPA1,Drp1等蛋白进行分析,从分子角度上验证了我们的结论。而之后通过应用JC-1分子探针及流式细胞术我们进一步发现,TGF-β在影响线粒体分裂/融合的同时也影响了线粒体膜电位的变化,而之后我们通过应用Seahorse能量代谢分析仪进一步明确了TGF-β经由自噬调节肿瘤细胞能力代谢的具体作用。6.TGF-β经由JNK及Smad信号通路调节胶质瘤的自噬水平根据既往的文献,我们首先通过Western blot发现TGF-β并非经由传统的AKT-mTOR通路激活细胞的自噬而是经由JNK通路对自噬产生了影响。由于TGF-β信号通路的下游存在Smad依赖及非Smad依赖两条途径,因而我们通过应用siSmad2干扰质粒也发现其对TGF-β诱导的自噬产生了影响。而同时经由Western blot及ELISA我们也可以观察到自噬对TGF-β的正反馈调节作用。之后通过应用TGF-β抑制剂及自噬抑制剂,我们进一步探讨了TGF-β调节自噬的可能机制,及TGF-β-autophagy-Lactate-TGF-β这一正反馈轴的可能性。7. Galunisertib及CQ的联合应用可降低胶质瘤的侵袭性并延长荷瘤小鼠生存期首先我们在NOD-SCID免疫缺陷的小鼠身上利用立体定向装置进行了胶质瘤的原位种植,并将老鼠分为三组：对照组、单药应用组及联合用药组。并应用3.0T MRI对小鼠颅内的肿瘤体积进行定期观察,并统计小鼠的生存期。结果显示,联合应用药物的小鼠生存显著延长。而将小鼠颅内的肿瘤取出并进行石蜡包埋,HE及IHC染色后我们可以发现,联合应用药物的肿瘤边缘浸润显著减少表明肿瘤的侵袭性减弱,同时IHC的结果表明Galunisert.b及CQ的联合应用也可以显著降低小鼠肿瘤内的TGF-β水平。结论1.TGF-β及LC3B在人胶质瘤中均成高表达且均与患者的生存期相关。2.TGF-β能够以时间依赖及浓度依赖的方式诱导胶质瘤自噬水平的升高。3.TGF-β诱导的胶质瘤自噬参与了肿瘤的侵袭及迁移。4.MMP蛋白及EMT转化可能是自噬影响胶质瘤侵袭的机制之一。5.TGF-β诱导的胶质瘤自噬同样对肿瘤代谢产生影响。6.TGF-β可能通过JNK及Smad通路调节胶质瘤的自噬水平。7.联合应用Galunisertib及CQ可显著改善种瘤小鼠的生存期。