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目的:DNA甲基化是真核细胞中常见的表观遗传修饰,其在基因表达的调控、细胞增殖等多种生理过程中发挥重要作用。另一方面,基因组中特定位点的异常甲基化可导致抑癌基因的沉默,并因此被认为是一种恶性肿瘤的标志物。因此临床上需对DNA甲基化位点进行灵敏而准确的定量检测。然而,目前的DNA甲基化位点检测方法由于一些缺点而在临床应用中受到限制,如灵敏度特异性不高、仪器昂贵、操作复杂等。因此本研究旨在建立一种灵敏特异且易于推广的甲基化DNA检测方法。方法:1.亚硫酸盐对甲基化DNA的转化、滚环扩增及酶切反应。目标甲基化DNA首先在亚硫酸盐处理后形成单碱基错配。在引入锁式探针、DNA连接酶和DNA聚合酶后,形成大量滚环扩增产物。经酶切后得到富G序列被切割下来。滚环扩增及酶切反应由琼脂糖凝胶电泳表征。2.核酸修饰的量子点的制备。在EDC的作用下量子点表面的羧基被活化以便与核酸偶联的氨基缩合,未结合的游离核酸经超滤被去除。核酸修饰的量子点经紫外吸收光谱、XPS、FTIR等进行表征。3.G-四联体/hemin复合物的自组装和荧光检测。量子点检测探针与酶切产物杂交后,与氯化血红素形成G-四联体/hemin复合物,在过氧化氢的辅助下增加淬灭率,进行荧光检测。结果:1.成功地通过亚硫酸盐处理将目标甲基化DNA形成单碱基错配,并通过锁式探针进行正确识别和滚环扩增。扩增产物经酶切处理后,得到了包含富G序列的酶切产物。2.通过一系列实验优化了实验条件。最终选择的试验条件为:RCA扩增的时间为2小时,引物浓度为20n M,dNTP浓度为600μM。氯化血红素的浓度为100nM,过氧化氢的浓度为0.5μM,荧光能量转移的时间为1小时。3.该检测系统具有良好的检测性能:在优化后的实验条件下,检测系统具有超高的灵敏度和特异性,检测限达到142fM,在1pM到100n M范围内呈良好的线性相关。结论:本研究基于滚环扩增和荧光共振能量转移,应用了两种信号放大机制,建立了一种超灵敏的DNA甲基化位点检测方法。通过滚环扩增对目标物进行扩增,同时利用过氧化氢辅助的荧光共振能量转移增强检测信号,双重放大系统使该检测方法具有超高的灵敏度,较高的重复性和低基质效应。此外,本研究建立的检测方法不需要特殊的仪器和试剂,可用于基层实验室开展,具有较高的临床应用价值。