【摘 要】
：
目的:本研究以富含亮氨酸重复激酶2（leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2）的ROC结构域蛋白及其相互作用的蛋白质分子（PAK5、PAK6）为研究对象,从分子生化水平上阐明ROC结构域蛋白与PAKs蛋白的分子间作用机理及内在联系,为LRRK2致病机理的研究提供新的分子机制及理论基础,为深入了解帕金森病的致病机理提供新的理论依据。方法:利用分子克隆技术制备带有不同标签蛋
论文部分内容阅读
目的:本研究以富含亮氨酸重复激酶2（leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2）的ROC结构域蛋白及其相互作用的蛋白质分子（PAK5、PAK6）为研究对象,从分子生化水平上阐明ROC结构域蛋白与PAKs蛋白的分子间作用机理及内在联系,为LRRK2致病机理的研究提供新的分子机制及理论基础,为深入了解帕金森病的致病机理提供新的理论依据。方法:利用分子克隆技术制备带有不同标签蛋白（GST、MBP、Myc等）的重组蛋白表达质粒（野生型及突变体）,包括全长蛋白（PAK5、PAK6）、ROC截短蛋白（1329-1520aa）、PAKs截短蛋白PAKs-GBD（10/11-55aa）,在原核大肠杆菌E.coli或哺乳动物细胞系（HEK293T细胞）中形成稳定蛋白表达系统。运用下拉实验（pull-down assay）检测其相互作用水平。利用原核生物蛋白表达系统进一步将蛋白分离纯化（主要包括亲和层析与凝胶过滤层析）,运用生物膜层干涉技术（Biolayer interferometry,BLI）-蛋白相互作用检测二者相互作用并计算Kd值;合成多肽分子PAKs-GBD（10-40aa）,N端用FITC-Ahx修饰,利用荧光偏振技术来检测二者相互作用并计算Kd值。结果:下拉实验的结果显示,ROC结构域的野生型不仅可与PAK6发生相互作用,也可与PAK5发生相互作用;ROC结构域内的致病突变/保护型突变、活性型、磷酸模拟型突变均能与PAK5、PAK6发生相互作用且对与PAK5、PAK6的相互作用无明显影响;虽然在截短蛋白PAKs-GBD与ROC结构域蛋白的下拉实验中,PAK5-GBD与ROC结构域蛋白的结合力明显弱于PAK6-GBD与ROC结构域蛋白的结合力,但是在全长蛋白PAKs与ROC结构域蛋白的下拉实验中,PAK5、PAK6与ROC结构域蛋白的相互作用无显著性差异。BLI技术-蛋白相互作用与荧光偏振实验的结果显示,ROC结构域的野生型与PAK6-GBD的相互作用的Kd值为14.68n M,与PAK5-GBD的相互作用的Kd值为14.96 n M,表明ROC结构域蛋白不仅可以与PAK6-GBD发生相互作用,也可以与PAK5-GBD发生相互作用,且PAK5-GBD、PAK6-GBD与ROC结构域蛋白的结合力无差异性;此外,ROC结构域蛋白的野生型与PAKs-GBD的相互作用的Kd值是致病突变的4～8倍,表明致病突变显著增强了ROC结构域蛋白与PAKs-GBD的相互作用;单磷酸模拟型突变与PAKs-GBD的相互作用的Kd值大约是野生型的1.5倍,而多磷酸模拟型突变与PAKs-GBD的相互作用的Kd值与野生型无差异性,提示ROC结构域的磷酸化的水平可影响ROC结构域蛋白与PAKs-GBD的相互作用;ROC结构域野生型、保护型突变的活性型与PAK6-GBD的Kd值是非活性型的1.5～2倍,PAK5-GBD与ROC结构域的活性型/非活性型的相互作用的Kd值无差异,提示ROC结构域蛋白的GTP活性型并不明显增强其与PAK6-GBD、PAK5-GBD的相互作用,ROC结构域蛋白与PAK5-GBD的结合属于非GTP依赖型结合。结论LRRK2 ROC结构域不仅可以与PAK6发生相互作用,也可以与PAK5发生相互作用;位于LRRK2 ROC结构域的致病突变可影响其与PAK5、PAK6的相互作用;LRRK2 ROC结构域蛋白与PAK5、PAK6的相互作用是非GTP依赖型结合。
其他文献
我国正构建以新能源为主体的新型电力系统。新能源的大规模接入、交直流混联电网的复杂结构、电力电子设备的应用使得电网故障呈现出更加复杂的模态。快速、准确的电网故障诊断是保障电网可靠运行的必要条件。数据驱动的新一代人工智能是新型电力系统的重要支撑技术手段。当前基于数据驱动的电网故障诊断方法在搭建模型时,缺乏对时序关系的表征,且无法表示拓扑关系,难以直接构建深度学习模型,无法完全满足电网对故障诊断的要求。
恢复高考已逾40年,尽管我国高等教育事业蓬勃发展,已实现从精英化、大众化到普及化阶段的迈进,但近年来高考复读人数依然呈现上升趋势,高考复读“持续增温”并已作为一种特殊的社会现象而存在,无疑催人深思。现有关于高考复读现象的研究,大部分建基于政策学的视角,分析高考复读相关政策的演变过程,兼以讨论高考复读的利弊。而针对高考复读生的探讨,则主要运用量的研究范式,沿心理学的进路对复读生的压力来源、自我效能感
运用无机陶瓷膜可以选择性地回收烟气中的水蒸气,得到高质量的冷凝水,并且该方法还具有系统简单,零污染物排放等优点。但是,由于价格昂贵的原材料,复杂的制备工艺以及较高的烧结温度,所以商业陶瓷膜制备成本和售价非常高,极大的限制了其在工程上广泛使用。本文将以粉煤灰为原材料,从源头上降低陶瓷膜的制备成本,并从烧结温度与造孔剂含量两个方面优化其的性能,研究两者对粉煤灰基陶瓷膜性能的耦合影响作用。最后将性能优化
电力系统的计算机模拟是电力行业规划、设计和运行的重要组成部分。由于电力系统负荷的增加,稳定性已成为人们关注的问题,因此,电力系统暂态行为分析程序已成为系统设计和控制的一个组成部分,以最大限度地提高系统承受严重干扰影响的能力。本研究旨在采用一种新的基于动态相量和传统电力系统仿真方法的通用电力系统仿真技术。本文提出的方法将时域电路转换为等效的动态相量表示。然后使用节点分析和数值积分替换对这些动态相量等
由于能源危机和环境问题的存在,促进可再生能源的发展以及对能源进行阶梯利用越来越受到重视,微能源网能够有效推动分布式能源的消纳和利用,所以得到了广泛的发展和应用。传统单一能源供应会造成很大程度的浪费,微能源网能够通过灵活有效的运行方式实现系统内多能互补从而满足一定区域内电、热、冷、气等多种负荷的协同供应。在传统的微能源网的基础上,利用冷热电联供系统解决了风光等可再生能源的消纳问题,含CCHP机组的微
本文以船体结构用10CrNiCu钢为研究对象,重点研究了制备工艺及Si含量对实验钢组织类型、晶粒尺寸和力学性能的影响规律,建立了成分、工艺、组织和低温韧性的匹配关系,降低了10CrNiCu船体钢的韧脆转变温度,使其满足极地服役环境温度对低温韧性的要求。本文主要结论如下:研究了再加热温度对实验钢组织和低温韧性的影响。结果表明,当再加热温度从1200℃降低至1100℃,实验钢的抗拉强度和屈服强度变化不
控制系统品质分析和监测的研究对于评价控制系统性能的优劣,预估系统故障,提高控制回路控制品质,保证生产过程的安全稳定运行以及优化机组性能等都具有重要的意义。本文对控制系统性能指标及影响控制系统性能指标的主要因素进行了论述,对国能智深工业大数据分析开发平台及算子开发相关技术包括Spark SQL大数据框架相关技术、JDBC技术、算子平台开发规则及需求等进行了说明。基于控制系统性能评价指标理论结合Jav
生物质与塑料共气化可通过原料之间的互补作用,改善气化产气特性,实现废弃物的清洁高效利用。由于不同塑料在结构与性质上存在较大差异,塑料与生物质共气化的相互作用机制与共气化反应特性目前尚不明确,仍需开展更加全面与深入的研究。本文以典型的木质纤维素类生物质杨木屑和三种典型的通用塑料聚乙烯（HDPE）、聚丙烯（PP）和聚氯乙烯（PVC）为原料,首先通过热重实验和固定床热解实验,探究了杨木屑与不同塑料共热解
建设基层服务型党组织是建设学习型、服务型、创新型马克思主义执政党的基础工程。加强高校基层服务型党组织建设是加强和改进高校党的建设的客观需求，是践行党的宗旨的现实需要，是落实立德树人根本任务的必然要求。加强高校基层服务型党组织建设必须完善不同类型基层党组织的服务机制，强化服务功能；创建一批贴近不同服务对象需求的服务载体，完善服务格局；打造一支素质高能力强的服务队伍，提升服务能力。
煤热解是煤炭清洁高效利用的重要方式之一,热解生成的中低温煤焦油产量大,组成复杂,其中酚类化合物含量高。如果对中低温煤焦油直接加氢转化,不仅浪费宝贵的酚类化合物资源,反应中生成的水也会影响催化剂活性和寿命。本文遵循“先分离后转化”的原则,着重开展如何从中低温煤焦油中有效分离酚类化合物的研究。本文首先分析了煤焦油中酚类化合物的馏分区间以及种类,然后配制了焦油模拟油,并设计和制备不同结构的天然低共熔溶剂