论文部分内容阅读
番茄（Solanum lycopersicum）是常见的温室栽培蔬菜。但是，高温、干旱、高盐等非生物胁迫因素对番茄的产量和生长发育产生了极大的影响。因此研究番茄耐非生物胁迫的机制对于提高番茄的逆境栽培以及育种效率具有非常重要的意义。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联能够影响植物对于生物胁迫和非生物胁迫的耐受性。MAPK级联是典型的三级联模式，主要包括MAPKKK（MAPK激酶激酶）、MAPKK（MAPK激酶）和MAPK。MAPK主要是通过磷酸化特定的下游底物来激活下游的细胞应答。研究MAPK的互作蛋白对于理解MAPK信号转导至关重要。
本实验室前期研究结果表明，番茄SlMPK1（促分裂原活化蛋白激酶）在逆境胁迫过程中发挥重要作用，但是其具体的分子基础和生理机制并不清楚。本研究前期通过Y2H筛选能够和SlMPK1相互作用的蛋白，发现一个未经报道的新蛋白ID(Solyc03g117670)命名为SlSKI。为了进一步深入探究番茄SlSKI的功能及作用机理，本研究对SlMPK1和SlSKI的相互作用进一步进行验证，并且通过转化拟南芥获得过表达SlSKI材料，以探讨SlSKI对于非生物胁迫的响应。此外，获得番茄SlSKI过表达和干扰材料。主要研究结果如下:
(1)通过原核表达及蛋白纯化，获得GST-SlSKI融合表达蛋白，并通过体外pull-down方法证明SlSKI能够和SlMPK1相互作用;体外磷酸化试验发现SlSKI未被磷酸化，证明其不是SlMPK1的磷酸化底物，可能是一种SlMPK1的调控蛋白;
(2)为了进一步确定相互作用的位点，截取SlSKI不同肽段，通过酵母双杂交的方法证明C末端的序列对于互作起关键作用;
(3)获得SlSKI过表达拟南芥材料。过表达SlSKI不影响拟南芥的正常生长发育，但是，在逆境条件下生长受抑制。通过观察高温、盐和干旱胁迫条件下种子萌发情况，根系的生长情况，发现SlSKI过表达株系的耐逆境能力降低，表明，SlSKI负调控拟南芥的非生物胁迫响应;
(4)构建SlSKI的过表达载体pBI121-SlSKI，基因敲除载体CRISPR-Cas9-SlSKI，以及RNA干扰载体pGSA1285-SlSKI-RNAi，通过番茄组培（农杆菌介导的子叶转化法）成功获得过表达和RNA干扰的阳性苗;
(5)通过qRT-PCR发现SlSKI在番茄中广泛表达，并且主要存在于成熟的红果和叶片中。不同逆境条件SlSKI的表达量发生变化，进一步表明SlSKI能够应答逆境信号。
本研究不仅有助于了解番茄SlSKI的分子生物学功能及可能的作用机理，同时也有助于进一步探究SlMPK1参与环境胁迫应答的分子机理。
本实验室前期研究结果表明，番茄SlMPK1（促分裂原活化蛋白激酶）在逆境胁迫过程中发挥重要作用，但是其具体的分子基础和生理机制并不清楚。本研究前期通过Y2H筛选能够和SlMPK1相互作用的蛋白，发现一个未经报道的新蛋白ID(Solyc03g117670)命名为SlSKI。为了进一步深入探究番茄SlSKI的功能及作用机理，本研究对SlMPK1和SlSKI的相互作用进一步进行验证，并且通过转化拟南芥获得过表达SlSKI材料，以探讨SlSKI对于非生物胁迫的响应。此外，获得番茄SlSKI过表达和干扰材料。主要研究结果如下:
(1)通过原核表达及蛋白纯化，获得GST-SlSKI融合表达蛋白，并通过体外pull-down方法证明SlSKI能够和SlMPK1相互作用;体外磷酸化试验发现SlSKI未被磷酸化，证明其不是SlMPK1的磷酸化底物，可能是一种SlMPK1的调控蛋白;
(2)为了进一步确定相互作用的位点，截取SlSKI不同肽段，通过酵母双杂交的方法证明C末端的序列对于互作起关键作用;
(3)获得SlSKI过表达拟南芥材料。过表达SlSKI不影响拟南芥的正常生长发育，但是，在逆境条件下生长受抑制。通过观察高温、盐和干旱胁迫条件下种子萌发情况，根系的生长情况，发现SlSKI过表达株系的耐逆境能力降低，表明，SlSKI负调控拟南芥的非生物胁迫响应;
(4)构建SlSKI的过表达载体pBI121-SlSKI，基因敲除载体CRISPR-Cas9-SlSKI，以及RNA干扰载体pGSA1285-SlSKI-RNAi，通过番茄组培（农杆菌介导的子叶转化法）成功获得过表达和RNA干扰的阳性苗;
(5)通过qRT-PCR发现SlSKI在番茄中广泛表达，并且主要存在于成熟的红果和叶片中。不同逆境条件SlSKI的表达量发生变化，进一步表明SlSKI能够应答逆境信号。
本研究不仅有助于了解番茄SlSKI的分子生物学功能及可能的作用机理，同时也有助于进一步探究SlMPK1参与环境胁迫应答的分子机理。