百草枯（paraquat，PQ），是目前世界范围内广泛使用的除草剂。随着其在我国农业上的广泛应用，PQ中毒也日趋增多。PQ经皮肤接触、呼吸道及消化道进入体内，造成急性中毒。PQ对人畜均有较强毒性，中毒致死剂量小，口服致死量为30-40mg／kg。PQ中毒病程进展快且目前尚无特效解毒药物，在临床上病死率很高，报道可高达80％以上。肺为PQ中毒的主要靶器官，也是百草枯中毒死亡的主要原因。大剂量中毒常由于急性肺损伤所致的呼吸衰竭及心、肝、肾等多脏器功能衰竭而死亡；较小剂量的中毒往往引起迟发性的肺纤维化，病程相对较长，晚期多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭。PO的肺毒性早期表现为急性肺泡炎，以后表现为进行性加重的肺间质纤维化。PO引起肺损伤及后期肺纤维化的病理生理机制还未阐明。由于在PQ中毒早期主要表现为急性肺泡炎性改变，因此有多种促炎细胞因子参与其中，p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinasesMAPK）作为MAPK家族的成员，其信号转导通路在炎性反应性疾病的发生和发展中具有重要调控作用，能被多种炎性刺激所激活，参与介导细胞应激反应、免疫反应和细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步等多种过程；而核因子κB（nuclear factor kappaB，NF-κB）是普遍存在于真核细胞中的一个转录因子，在炎症反应的细胞因子网络调节中起关键作用，最新研究发现NF-κB可以氧自由基激活，这种活化效应可被抗氧化剂所抑制。近年来研究表明，肺间质纤维化是细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的过度沉积造成的，这种过度沉积不仅是由于ECM合成增多，更大程度上是ECM降解减少即合成和降解不平衡引起的。其中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）及其组织抑制因子（tissueinhibitor of metalloproteinnase，TIMPs）在ECM合成／降解的调节过程中起着非常重要的作用，而在某些MMPs基因的启动子区域存在有NF-κB的结合位点。TGF-β₁是参与肺纤维化的细胞因子中研究最深入、作用最重要的因子。它能促进成纤维细胞合成胶原蛋白、纤维连结蛋白、蛋白多糖等细胞外基质，促进细胞外基质的沉积；它还能减少基质降解蛋白酶的产生，增加这些蛋白酶抑制物的水平，因此其在肺纤维化过程中起重要作用。褪黑素（melatonin，MT）是由松果体分泌的一种吲哚胺类激素，研究发现MT具有高亲脂性，因此具有高度弥散穿透能力，能在细胞膜、胞浆和细胞核中发挥抗氧化作用。MT可有效清除化学反应中的氧自由基，亦可抑制过氧化氢引起的过氧化脂质含量的升高，还能增强体内抗氧化酶的活性，故能有效保护生物大分子如脂质、DNA免受自由基损伤，从而对氧自由基的损伤起保护作用。是目前已知的抗氧化作用最强的内源性自由基清除剂。推测MT能减轻PQ所致组织过氧化损伤和肺纤维化形成。p38MAPK、NF-κB、TGF-β₁、MMPs和TIMPs在PQ中毒所致肺损伤中的变化以及MT对它们的影响在国内外尚未见报道。本研究试图通过PQ灌胃染毒制成PQ中毒模型，并给予MT作为干预措施，观察其病情变化及不同时间体内肺组织病理改变，及肺组织中p38 MAPK、NF-κB、TGF-β₁、MMPs与TIMPs的表达变化，了解它们在PQ中毒肺损伤中的作用，进一步探讨PQ中毒肺损伤的发病机制及MT对PQ中毒的治疗作用。本实验共包括三个部分。第一部分急性百草枯中毒大鼠肺间质改变及其调控机制目的：观察PQ中毒大鼠体内丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活力及肺组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达的变化，探讨它们在PQ中毒所致肺组织损伤中的作用。方法：选择健康成年SD大鼠48只，随机分为两组：对照组（A组）6只，染毒组（B组）42只。B组应用PQ50mg／kg灌胃制作染毒模型；A组生理盐水（NS）灌胃。分别于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取6只大鼠，氯胺酮麻醉后开胸，先心脏取血，测定血清MDA、SOD及GSH-Px活力；而后迅速留取肺组织，测定肺组织匀浆羟脯氨酸含量，采用RT-PCR法测定肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA的表达；另取肺组织行HE染色、Masson染色、免疫组织化学染色及电镜观察。A组行同样处理。结果：1．大鼠中毒表现：B组大鼠在染毒后30min～2h即可出现中毒表现，在染毒1～3天最明显。主要表现为：倦怠、嗜睡、烦躁、进食水明显减少；呼吸急促、张口呼吸、口周紫绀；走路不稳、肢体无力、头颤；体重明显下降、松毛、眼鼻血性分泌物、腹泻等。约3d后大鼠中毒症状逐渐好转，7d后体重开始增加。2．血清与肺组织匀浆指标测定：①B组大鼠血清MDA含量在1d、3d和7d时明显高于A组（P＜0.01）；14d及以后各时点血清MDA与A组比较不再有统计学意义（P＞0.05）。②B组大鼠血清SOD活力染毒后1d即明显下降，7d时血清SOD活力仍明显低于A组（P＜0.01）；14d及以后各时点血清SOD活力与A组比较无统计学意义（P＞0.05）。③B组大鼠血清GSH-Px染毒后1d活力下降，染毒后3d仍明显低于A组（P＜0.05）；7d及以后各时点则与A组比较无明显差异（P＞0.05）。④B组大鼠肺组织匀浆HYP含量于染毒1d、3d、7d与A组比较无统计学意义（P＞0.05）；14d及以后各时点均明显高于A组（P＜0.05）。3．百草枯中毒大鼠肺组织学变化：①HE染色结果：A组光镜下可见肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡腔无炎性细胞浸润，偶有少许红细胞。B组早期为肺泡炎性改变，如肺泡壁毛细血管扩张、瘀血，炎性细胞浸润，肺水肿、弥漫肺出血及肺泡腔塌陷，部分透明膜形成等；后期可见肺泡塌陷明显，成纤维细胞增多，部分肺泡间隔纤维性增厚，可见胶原纤维增生，出现纤维化改变。②Masson染色结果：A组在支气管周围及肺泡间隔区有少量着色绿色的胶原纤维。B组染毒早期（1d、3d、7d）未见明显胶原纤维增生；染毒14d以后可见支气管管壁与肺泡间隔呈纤维性增厚，部分区域胶原纤维不规则排列，阳性面积百分比明显高于A组（P＜0.05）。③电镜观察：A组肺组织超微结构无明显异常变化。B组可见到肺泡腔内有水肿渗出液，内含破碎细胞器及红细胞，间质炎性细胞浸润，肺泡Ⅰ型上皮细胞受损，基膜断裂；以后可见肺泡间隔增厚，内含大量增生、肥大的肺泡Ⅱ型上皮细胞，板层小体空泡化，并且可见胶原纤维向肺泡上皮下和毛细血管基底膜内生长。4．MMP-2、MMP-9及TIMP-1免疫组织化学检测结果：①MMP-2、MMP-9及TIMP-1在A组正常大鼠肺组织中均有少量表达，三者分布范围基本一致，分布在支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及肺内巨噬细胞。②B组大鼠在染毒1d肺组织中MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达即明显强于A组（P＜0.01）；主要分布在肺内巨噬细胞、支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞，血管内皮细胞也有表达，后期还可见其它肺间质细胞有表达。MMP-2至35d时表达减弱，与A组比较无统计学意义（P＞0.05）；MMP-9至21d时表达减弱，与A组比较无统计学意义（P＞0.05）；而TIMP-1呈持续高水平表达，至35d时表达仍明显高于A组（P＜0.01）．5．大鼠肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA的表达：①A组大鼠肺组织中仅有少量MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA的表达。②B组大鼠肺组织中MMP-2 mRNA的表达从1d就明显增强（P＜0.01）；7d时达高峰；此后开始下降，但直至染毒后28d仍明显强于A组（P＜0.05）；35d以后与A组相比无统计学差异（P＞0.05）。MMP-9 mRNA的表达在染毒1d开始增强（P＜0.01）；3d即达高峰；7d时仍高于A组（P＜0.01）；染毒14d及以后与A组相比无统计学意义（P＞0.05）。而TIMP-1 mRNA的表达从1d就明显增强（P＜0.01）；14d达高峰；以后持续维持较高水平，至35d仍明显高于A组（P＜0.01）。结论：1．百草枯中毒引起的肺损伤主要表现为早期的急性肺泡炎和以后逐渐进展的肺间质纤维化。2．百草枯中毒大鼠体内MDA含量升高、SOD及GSH-Px活力下降，说明PQ可引起肺内炎性反应，进而产生的过氧化损伤及肺内氧化-抗氧化系统失衡是造成急性肺损伤的主要机制。3．百草枯中毒致急性肺损伤后，肺内MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达不同步造成ECM合成和降解不平衡，从而诱导肺纤维化形成。第二部分急性百草枯中毒大鼠肺组织中NF-κB、TGF-β₁及p38MAPK的变化研究目的：观察中毒大鼠肺组织中NF-κB活性、TGF-β₁及磷酸化p38MAPK的变化，探讨其在急性百草枯中毒所致肺损伤中的作用。方法：选择健康成年SD大鼠48只，随机分为两组：对照组（A组）6只，染毒组（B组）42只。B组于染毒后1d、3d、7d、14d、21d，28d、35d各取6只大鼠，留取肺组织。采用电泳迁移率改变分析法（EMSA）测定NF-κB活性，Western blot法测定磷酸化p38MAPK蛋白表达，RT-PCR法测定MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β₁ mRNA的表达；同时行免疫组织化学观察。A组行同样处理。结果：1．大鼠肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1、NF-κBp65及TGF-β₁免疫组织化学检测结果：①MMP-2、MMP-9及TIMP-1在A组正常大鼠肺组织中均有少量表达，三者分布范围基本一致，分布在支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及肺内巨噬细胞。B组大鼠在染毒1d肺组织中MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达即明显强于A组（P＜0.01）；主要分布在肺内巨噬细胞、支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞，血管内皮细胞也有表达，后期还可见其它肺间质细胞有表达。MMP-2至35d时表达减弱，与A组比较无统计学意义（P＞0.05）；MMP-9至21d时表达减弱，与A组比较无统计学意义（P＞0.05）；而TIMP-1呈持续高水平表达，至35d时表达仍明显高于A组（P＜0.01）．②NF-κBp65在A组正常大鼠肺组织中表达较弱，主要分布在支气管上皮细胞，以胞浆为主；在B组大鼠肺组织中表达范围明显扩大，支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺巨噬细胞、血管内皮细胞及其它的肺间质细胞的胞浆及胞核内均有表达。1d至14d其阳性面积百分比明显高于A组（P＜0.01）；21d及以后NF-κBp65表达减弱，与A组比较无统计学意义（P＞0.05）。③TGF-β₁在A组大鼠肺组织中有少量表达，主要分布在支气管上皮细胞及少数血管内皮细胞，偶见肺泡巨噬细胞表达。B组在染毒后1d即明显强于A组（P＜0.01）。早期可见细支气管上皮细胞、少数肺泡上皮细胞及血管内皮细胞表达，以后可见大量TGF-β₁强阳性的肺巨噬细胞；还可见其它肺间质细胞表达。至35d时TGF-β₁表达仍较A组高（P＜0.01）。2．大鼠肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β₁ mRNA的表达变化：A组：正常大鼠肺组织中即有少量MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β₁ mRNA的表达。B组：大鼠肺组织中MMP-2 mRNA的表达从1d就明显增强（P＜0.01）；7d达高峰；此后开始缓慢下降，但直至28d仍明显强于对照组（P＜0.05）；35d以后则与对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。MMP-9mRNA的表达1d开始增强（P＜0.01）；3d时达高峰；7d时仍高于对照组（P＜0.01）；14d及以后与对照组相比无统计学意义（P＞0.05）。而TIMP-1mRNA的表达从1d就明显增强（P＜0.01）；14d达高峰；以后维持在高水平，至35d仍明显高于对照组（P＜0.01）。TGF-β₁ mRNA的表达从1d就明显增强（P＜0.01）；14d达高峰；以后维持在较高水平，至35d仍明显高于对照组（P＜0.01）。3．大鼠肺组织NF-κB活性的变化：A组大鼠肺组织NF-κB活性很低。而在B组自染毒1d即较A组显著升高（P＜0.01）；3d时达到高峰（P＜0.01）；7d及14d时仍高于A组（P＜0.01）；21d及以后与A组相比无统计学意义（P＞0.05）。4．大鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的变化：A组大鼠肺组织磷酸化p38MAPK表达较少。B组大鼠肺组织磷酸化p38MAPK自1d开始较A组显著升高（P＜0.01）；3d时达到高峰（P＜0.01）；7d及14d时仍高于A组（P＜0.05）；21d及以后与A组相比无统计学意义（P＞0.05）。结论：本研究显示，中毒大鼠肺组织中NF-κB、p38MAPK及TGF-β₁表达均明显增强，与MMPs／TIMPs的异常表达及比例失衡密切相关。它们之间相互作用，互为因果，参与了肺组织的炎性损伤、组织结构破坏以及随后的组织修复过程，从而引起肺组织损伤和肺纤维化形成。其中NF-κB和p38MAPK在中毒早期表达增强，可能在肺泡炎阶段起重要作用；而TGF-β₁在中毒后期仍维持高水平，与TIMP的变化一致，可能在纤维化形成过程中发挥更为关键的作用。第三部分褪黑素治疗急性百草枯中毒大鼠肺损伤的分子机制研究目的：观察褪黑素（MT）对染毒大鼠体内MDA、SOD、GSH-Px活力及肺组织MMPs、TIMPs、NF-κB、TGF-β₁及p38MAPK表达的影响，探讨MT对急性百草枯中毒的治疗效果。方法：选择健康成年SD大鼠90只，随机分为三组：①对照组（A组）6只；②染毒组（B组）42只；③MT治疗组（C组）42只：PO灌胃染毒后，给予MT10mg／kg腹腔注射，每日一次；A组和B组每日给予等量NS腹腔注射。分别于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取6只大鼠，氯胺酮麻醉后开胸，先心脏取血，测定血清MDA、SOD及GSH-Px活力；而后迅速留取肺组织，测定肺组织匀浆羟脯氨酸含量；采用RT-PCR法测定肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β₁ mRNA的表达；电泳迁移率改变分析法（EMSA）测定NF-κB活性；采用Western blot法测定磷酸化p38MAPK蛋白表达；另取肺组织行HE染色、Masson染色及免疫组织化学染色。A组行同样处理。结果：1．大鼠中毒表现：B组大鼠在染毒后主要表现为倦怠、嗜睡、烦躁、进食水明显减少；呼吸急促、张口呼吸、口周紫绀；走路不稳、肢体无力、头颤；体重明显下降，松毛、眼鼻血性分泌物、腹泻等。C组经MT治疗后症状体征较B组减轻，尤其是呼吸困难明显减轻，大鼠染毒后体重下降不明显。2．血清与肺组织匀浆指标测定：①B组大鼠血清MDA含量在1d、3d和7d时明显高于A组（P＜0.01）；而在C组MT明显抑制了染毒大鼠血清MDA升高趋势，1d、3d及7d时MDA均较B组明显降低（P＜0.05），仅1d和3d时与A组比较有统计学意义（P＜0.05）。②B组大鼠血清SOD活力染毒后1d、3d和7d时均明显低于A组（P＜0.05）；C组MT明显增加了染毒大鼠血清SOD活力，1d、3d、7d时SOD活力均较B组增高（P＜0.05）；仅1d与3d时与A组比较有统计学意义（P＜0.05）。③B组大鼠血清GSH-Px活力染毒后1d和3d时明显低于A组（P＜0.05）；C组MT明显增加了染毒大鼠血清GSH-Px活力，1d和3d时GSH-Px活力较B组增高（P＜0.01）；所有时间点与A组比较无统计学意义（P＞0.05）。④B组大鼠肺组织匀浆HYP含量于染毒1d、3d、7d与A组比较无统计学意义（P＞0.05）；14d及以后均明显高于A组（P＜0.05）。C组经MT干预后，1d、3d、7d及14dHYP含量，与同时间点A组比较无统计学意义（P＞0.05）；但21d及以后HYP含量明显高于A组同时间点，但仍明显低于B组（P＜0.05）。3．百草枯中毒大鼠肺组织学变化：①HE染色结果：A组光镜下可见肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡腔无炎性细胞浸润，偶有少许红细胞。B组早期为肺泡炎性改变，如肺泡壁毛细血管扩张、瘀血，炎性细胞浸润，肺水肿、弥漫肺出血及肺泡腔塌陷，部分透明膜形成等；后期可见肺泡塌陷明显，成纤维细胞增多，部分肺泡间隔纤维性增厚，可见胶原纤维增生，出现纤维化改变。C组MT干预明显减轻了大鼠急性肺泡炎病理改变，早期病变介于A组与B组之间；同时对后期胶原纤维增生有一定抑制作用。②Masson染色结果：A组在支气管周围及肺泡间隔区有少量绿色的胶原纤维。B组染毒早期（1d、3d、7d）未见明显胶原纤维增生；染毒14d以后可见支气管管壁与肺泡间隔呈纤维性增厚，部分区域胶原纤维不规则排列，阳性面积百分比明显高于A组（P＜0.01）。C组MT干预后，1d至14d时未见明显胶原纤维增生；染毒21d以后可见胶原纤维逐渐增多，但仍低于B组（P＜0.05）。4．治疗前后MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β₁及NF-κBp65免疫组织化学检测结果：①A组：MMP-2在正常大鼠肺组织中很弱的表达。B组：染毒后1d至28d时肺组织中MMP-2表达明显高于A组（P＜0.05）：至35d时MMP-2表达减弱，与A组比较无统计学意义（P＞0.05）。C组：肺组织中MMP-2表达在1d至28d时明显弱于B组（P＜0.05）；但在1d至21d仍明显高于A组（P＜0.01）。②A组：MMP-9在正常大鼠肺组织中表达很弱。B组：染毒后肺组织中MMP-9表达增强，在1d至14d，阳性面积百分比与A组比较有统计学意义（P＜0.05）。C组：肺组织中MMP-9表达在1d至14d明显弱于B组，（P＜0.01）；但在1d至7d时仍高于A组（P＜0.01）。⑧A组：TIMP-1在正常大鼠肺组织中有少量表达。B组：染毒后1d肺组织中TIMP-1表达即明显强于A组（P＜0.01）；至35d时仍高于A组（P＜0.01）。C组：肺组织中TIMP-1明显减弱，在1d至35d均弱于B组（P＜0.01）；但各时间段仍强于A组（P＜0.01）。④A组：NF-κBp65在正常大鼠肺组织中表达很弱，以胞浆为主。B组：染毒早期肺组织中NF-κBp65表达即增强，在1d至14d，阳性面积百分比与A组比较有统计学意义（P＜0.01）。C组：肺组织中NF-κBp65表达在1d至14d明显弱于B组（P＜0.01）；但在1d至7d时仍明显高于A组（P＜0.01）。⑤A组：TGF-β₁在正常大鼠肺组织中有少量表达。B组：染毒后1d肺组织中TGF-β₁表达在1d至35d时均明显高于A组（P＜0.01）。C组：肺组织中TGF-β₁表达在1d至35d时均明显弱于B组（P＜0.01）。但各时间点仍强于A组（P＜0.01）。5．治疗前后肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β₁ mRNA的变化：①MMP-2 mRNA的表达：A组：正常大鼠肺组织中即有少量MMP-2mRNA的表达。B组：大鼠肺组织中MMP-2 mRNA的表达从1d就明显增强（P＜0.01）；7d达高峰；14d至28d仍明显强于A组（P＜0.05）；35d与A组相比无统计学差异（P＞0.05）。C组：MMP-2 mRNA的表达自1d至28d时均较B组明显减弱（P＜0.05）；但在1d至14d时仍明显高于对照组（P＜0.01）；21d及以后与对照组相比无统计学意义（P＞0.05）。②MMP-9mRNA的表达：A组：正常大鼠肺组织中MMP-9 mRNA的表达很少。B组：MMP-9 mRNA的表达1d开始增强（P＜0.01）；3d时达高峰，以后逐渐减弱；14d及以后与A组相比无统计学意义（P＞0.05）。C组：MMP-9mRNA的表达自1d至7d时较B组明显减弱（P＜0.05）；仅1d至3d时高于A组（P＜0.01）；7d及以后与A组相比无统计学意义（P＞0.05）。③TIMP-1mRNA的表达：A组：正常大鼠肺组织中即有少量TIMP-1 mRNA的表达。B组：TIMP-1 mRNA的表达从1d就明显增强（P＜0.05）；14d达高峰（P＜0.01）；以后维持在高水平，至35d仍明显高于A组（P＜0.01）。C组：TIMP-1 mRNA的表达从1d至35d均较B组明显减弱（P＜0.05）；但在1d至28d时均高于A组（P＜0.05）。④TGF-β₁ mRNA的表达：A组：正常大鼠肺组织中即有TGF-β₁ mRNA的表达。B组：大鼠肺组织中TGF-β₁ mRNA的表达从1d就明显增强（P＜0.01）；14d达高峰（P＜0.01）；以后维持在较高水平，至35d仍明显高于A组（P＜0.01）。C组：TGF-β₁ mRNA的表达从1d至35d均较B组减弱（P＜0.05）；但所有时间点仍高于A组（P＜0.05）。6．治疗前后染毒大鼠肺组织NF-κB活性的动态变化：A组大鼠肺组织NF-κB活性很低。B组大鼠肺组织NF-κB活性1d开始较A组显著升高（P＜0.01）；3d时达高峰（P＜0.01）；7d及14d时仍高于A组（P＜0.01）。C组NF-κB活性较B组明显减弱（P＜0.01）；在1d时最高，以后逐渐下降，在14d时与A组相比无统计学意义（P＞0.05）。7．染毒大鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的变化：A组大鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白表达较少。B组大鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白1d开始较A组显著升高（P＜0.01）；3d时达高峰（P＜0.01）；以后逐渐下降，21d及以后与A组相比无统计学意义（P＞0.05）。C组磷酸化p38MAPK蛋白表达1d至14d时较B组明显减弱（P＜0.01）；仅1d至7d时高于对照组（P＜0.05）；在14d时与A组相比无统计学意义（P＞0.05）。结论：应用MT治疗，可明显降低百草枯中毒大鼠血清MDA含量，增加SOD及GSH-Px活力；减轻染毒大鼠肺组织早期的炎性改变及后期的肺纤维化趋势，这可能与MT较强的抗氧化功能以及降低肺组织NF-κB活性，减少TGF-β₁、磷酸化p38MAPK的表达，调节MMPs和TIMPs之间的平衡有密切关系。