胰腺癌是恶性程度极高的肿瘤，由于早期难于诊断，局部侵袭力高、早期易转移以及对化疗产生抵抗的特点，导致胰腺癌病人的预后非常差。手术治疗的复发率达20-25％，术后主要采用化疗药物吉西他滨或/和5-Fu治疗。但是由于化疗药物毒性及耐药等缺点，导致胰腺癌患者的治疗效果不佳，5年生存率仍小于5％[1-3]。由于胰腺癌的发生是一个多基因异常引起的复杂病理过程。因此，干预多条信号通路的新靶点药物可能具有更大的治疗前景。　　热休克蛋白90(HSP90)作为重要的分子伴侣，能够辅助蛋白折叠、装配和成熟，维持多种信号传导蛋白的稳定，从而保持细胞生长和存活[4]。大多数已鉴定的HSP90的客户蛋白是癌蛋白[5]。如:跨膜的酪氨酸激酶(HER-2、EGFR、IGFR)，信号蛋白（AKT、c-RAF、P53、V-src），细胞周期调节者(CDK4、CDK6)和转录因子（STAT3和HIF-1α）等，这些癌蛋白直接参与胰腺癌的生长和血管生成。HSP90在包括胰腺癌在内的许多肿瘤细胞中高表达，可达正常细胞的2～10倍，可使肿瘤中过度激活或突变的癌客户蛋白保持活性和避免降解，从而加速肿瘤增殖和恶性转变[6]。阻断HSP90的分子伴侣功能，能够使许多癌蛋白同时失去稳定性并降解失活，达到“一靶多效”的抗癌效果[4]。而且肿瘤细胞中具有特定的HSP90活性超伴侣复合体结构，使HSP90抑制剂的亲和力比对正常细胞高出100倍，这使得HSP90成为备受关注的抗肿瘤新靶点[7]。　　HSP90是同源二聚体，每个单体包括三个高度保守的结构域:N端与ATP结合结构域(P1-E245)、中间结构域(K246-D528)和C端二聚化结构域(G529-D723)。ATP与HSP90 N末端结合以及ATP被HSP90 ATPase水解驱动HSP90构象循环，维持HSP90的活性[8，9]。目前，大多数HSP90抑制剂是针对其N末端ATP结构域设计，其中一些已经进入临床前或临床抗肿瘤研究。格尔德霉素类(GAs)是最早被发现的HSP90抑制剂，其中17-AAG是经典的HSP90 N末端抑制剂，具有很强的抗肿瘤活性（IC50可达10-8～-9M）[10]。然而GAs存在很多不足，如严重的肝脏毒性、依赖体内醌还原酶NQO1和P450 CYP3A4的代谢活化及易产生耐药等，限制了其临床应用[11]。随着化学结构和高通量筛选技术地迅猛发展，一些具有嘌呤骨架或间苯二酚结构的HSP90抑制剂被开发，如PU3、CCT018159和VER-52296等。晶体衍射和构效关系研究表明，具有间苯二酚异噁唑结构的VER-52296可以嵌入HSP90ATP口袋，可显著地降低癌蛋白c-RAF和HER-2等，从而发挥广谱的抗肿瘤增殖作用[12]。然而，研究显示VER-52296对正常细胞具有同样的活性[13]。在Ⅰ期临床研究中，一些注射VER-52296的实体瘤患者出现了恶心、呕吐、夜盲等不良反应[14]。　　因此，这部分课题的研究目标是建立筛选N末端HSP90抑制剂的荧光偏振体系;对80个具有全新结构的间苯二酚衍生物进行HSP90亲和活性的筛选，并评价其对肿瘤细胞的生长抑制作用;对候选化合物Y306zh进行体内、外抗肿瘤药效学评价;并阐明Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子机制，为该类化合物的后续研发奠定坚实的实验基础。　　本研究工作由以下四部分内容组成:　　1)诱导并纯化人源重组HSP90α蛋白，建立用于HSP90抑制剂筛选的荧光偏振体系　　将pET24α(+)-HSP90α重组质粒转化至BL21(DE3)，经1mM IPTG诱导蛋白表达，采用Ni-NTA亲和层析树脂纯化HSP90α蛋白。选用VER00051001为探针分子，检测不同浓度HSP90α蛋白或探针分子对荧光偏振值的影响，并采用HSP90抑制剂NVP-AUY922和GA验证荧光偏振体系是否建立成功。　　2) HSP90抑制剂的筛选　　随机地选择7种常用的人源性肿瘤细胞株，采用MTT法，对两批送样的具有间苯二酚三氮唑或异噁唑的80个化合物进行细胞毒检测。分别选取细胞毒活性较好的化合物，采用荧光偏振法对其与HSP90的亲和力进行初筛和复筛，得到候选化合物。其中，化合物Y306zh在酶学和细胞水平均显示出较好的活性，为此对其进行深入地抗肿瘤机制研究。　　3)候选化合物Y306zh的体内、外抗胰腺癌增殖作用研究　　采用MTT法，检测了Y306zh对15株人肿瘤细胞株的生长抑制作用，筛选出Y306zh的敏感瘤株为胰腺癌。并检测Y306zh对五株具有不同程度HSP90α表达的胰腺癌细胞和正常细胞的生长抑制作用。采用流式细胞术检测Y306zh对胰腺癌细胞周期阻滞，及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。在胰腺癌Mia-paca2细胞的裸鼠异体移植瘤实验中，通过检测荷瘤鼠体重、瘤体积和瘤重的变化，以及瘤组织中增殖指标Ki-67的阳性率，来评价Y306zh的体内抗胰腺癌作用。　　4) Y306zh抑制胰腺癌增殖的分子机制研究　　采用荧光偏振技术检测Y306zh与HSP90 N末端的亲和力。采用ATP琼脂糖小球结合实验和免疫共沉淀实验分别检测Y306zh对胰腺癌细胞内ATP结合型的HSP90活性形式及HSP90与辅助分子伴侣p23、CDC37的相互作用。采用免疫印迹实验检测Y306zh对胰腺癌发生发展密切相关的两个重要客户蛋白EGFR和IGF-1Rβ的表达，及其下游PI3K/AKT和MAPK信号通路中关键分子蛋白表达的影响。预先给予蛋白酶体抑制剂MG132，检测是否逆转Y306zh对客户蛋白EGFR、IGF-1Rβ、AKT、c-RAF和CDK4的降解作用。采用免疫共沉淀实验检测Y306zh诱导客户蛋白的泛素—蛋白酶体降解是否与HSP90-HSP70-CHIP-客户蛋白复合体的形成相关。　　综上所述，本课题取得的主要进展如下:　　1)采用pET24α(+)-HSP90α原核表达系统，成功地诱导表达并纯化了具有活性的HSP90α蛋白，建立并优化了用于HSP90抑制剂筛选的荧光偏振体系。　　2)从80个具有间苯二酚三氮唑或异噁唑结构的化合物中筛选出24个化合物，它们对肿瘤细胞生长抑制作用的IC50值在10-6～10-7M。并且绝大多数化合物(～20个)可与VER00051001竞争性结合HSP90，IC50值在10-7～10-8M。　　3) Y306zh是一种全新结构的有效的HSP90抑制剂，具有较好的体内、外抗胰腺癌作用，并且具有较好的肿瘤选择性和安全性。　　4)Y306zh可以通过抑制ATP与HSP90的结合，并阻碍p23与HSP90的相互作用，从而抑制HSP90的分子伴侣活性，导致胰腺癌中优势客户蛋白IGF-1Rβ和EGFR去稳定化，并抑制其介导的PI3K/AKT和MAPK两大增殖/存活信号通路，发挥抗胰腺癌增殖作用。