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尼古丁是香烟烟的主要成分之一，它对人类健康具有极大的危害。流行病学资料显示，在长期吸烟的人群中，由于对尼古丁的累积摄入，可以促进各种肺部和心血管系统的疾病，如慢性阻塞性肺病(COPD)、动脉粥样硬化、肿瘤等。血管内皮细胞在炎性因子作用下可以释放选择素E(Eselectin)，血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，细胞间粘附分子(ICAM-1)等多种细胞表面的及可溶性的粘附分子，它们通过识别白细胞上相应的配体来介导血流中的白细胞与血管内皮细胞的粘附及穿越内皮间隙，在局部组织中募集，从而维持机体内环境的稳定。在介导炎性介质分泌的过程中，巨噬细胞扮演了重要角色，它在处理抗原、抗原呈递、调节免疫功能等各个方面发挥着重要的作用。 本研究旨在探讨在尼古丁的作用下，巨噬细胞是如何分泌细胞因子的，这些细胞因子的改变又是如何影响血管内皮细胞粘附分子表达的，并进一步了解在作用过程中起主要作用的细胞因子。 1．尼古丁诱导的巨噬细胞因子的表达 巨噬细胞是参与免疫反应的重要免疫细胞，它可以分泌多种细胞因子如TNF-α，IL-1β，IL-8，IFN-γ等，在免疫反应中有重要意义。本实验研究了不同浓度尼古丁诱导的巨噬细胞炎性因子表达的情况。将体外培养的巨噬细胞按予以尼古丁4种不同浓度(0.002M，0.006M，0.01M，0.02M)分4组，每组又分空白对照和尼古丁处理组，在3，6，12，24，48小时后收取细胞及其上清，利用放射免疫和酶联免疫吸附实验的方法对上清的4种细胞因子进行测定。 结果显示：1．尼古丁低浓度组(0.002M，0.006M)可以使巨噬细胞分泌的TNF-α，IL-1β表达增高，在尼古丁0.006M时，TNF-α在24小时(5.767±1.440 ng／ml)，IL-1β在12小时(0.14±0.033ng／ml)分别达到最山西医科大学硕士学位论文高值;高浓度组(0.olM，0.02M)明显抑制其表达;11厂8，IFN一Y变化不显著。 上述结果表明:尼古丁对巨噬细胞分泌TNF一u，IL一上p有浓度和时间依赖性，且在0.006M时可诱导巨噬细胞因子‘fNF一。，工L一p最高表达，而高于此浓度后有一定的抑制作用。尼古丁对工L一8，H了N一Y的作用规律不显著。2.巨噬细胞介导的尼古丁对血管内皮细胞粘附因子表达中的作用 关于细胞因子诱导的内皮细胞粘附分子表达的影响报道众多，而有关尼古丁及巨噬细胞在其中的作用报道甚少，且起主要作用的细胞因子尚不完全明了。本实验观察了尼古丁对巨噬细胞因子介导的lfl!_管内皮细胞与单核细胞的粘附现象及其粘附分子的表达变化，井进行了研究。 根据上一部分的实验结果，即用不同浓度的尼古丁在不同时间点刺激巨噬细胞时，0.OO6M的尼古丁在24小时的时间J点上可使巨噬细胞分泌细胞因子( TNF一“，IL一lp)均达到较高浓度。因此我们采用新鲜收集的0.OO6M的尼古丁处理巨噬细胞24小时后得到的上清作为下一步实验的刺激因素进而研究由巨噬细胞介导的尼古丁对血管内皮细胞的作用。 将体外培养的人脐带血管内皮细胞(Il UVECS)予以巨噬细胞上清 (尼古丁0.oo6M处理组24小时收集)刺激，在不同时问点加入新鲜分离的单核细胞，1小时后观察粘附结果。同时在IIUVECS经巨噬细胞上清处理后，在各时间点(0，3，9，12，ZJ，招小时)收取血管内皮细胞，采用EL工SA，半定量RT一PcR和流式细胞术检测细胞可溶性粘附分子(S工以M-l，sVCAM一l，sE一seleetin)及细胞表面粘附因子(工c八M一l，veAM一1，E-seleetin)表达情况，分析结果后，得到SvCAM一l，SE一SeleCtin及vCAM-l，E一SeleCtin在9小时表达最高，51以M一1及IC八M一在24小时表达可达到最高，相应的流式结果I以M一l在Zd小时表达可达到最高，比O小时对照组增加了65%。在此基础上，我们分别在粘附分子最高表达的时间点 (即9和24小时)土进行粘附封闭实验研究巨噬细胞中的主要作用因子。用抗‘I’N卜。，抗lI.一lp，抗‘fNI:一+抗]l.一lp，抗比一8，抗Il:N一Y的抗体对巨噬细胞上清(尼古丁0.OO6M处理组24小时新鲜收集)封闭l小时后束d激血管内皮到11胞，然后分别在9和Zd小时收取I二清(行可溶吐山西医利大学硕士学位论文粘附分子测量)后，再加入新鲜分离的单核细胞，一小时后观察粘附结果。 结果表明:1.粘附实验分析发现巨噬细胞上清处理组的粘附率高于空白对照组。2.ELI队分析发现，单独巨噬细胞上清处理组SIC八M一1在24小时表达最高，sVeAM一1，sE一seleetin在9小11寸表达最高(数据同上)。3.半定量盯一l〕CI之分析与上述结果相似，即Ic八M一1在24小时表达最高，VCAM一1，E一SeleCtin在9小11寸表达最高:流式细胞术也证实ICAM一1在24小时有最大表达。4.封闭实验证明了在抗TNI矛一。，抗儿一!p，抗TNF一u十抗IL一lp抗体处理组中粘附率较单纯_{二清处理组有明显下降，而抗IL-8，抗[刚一Y的抗体处理组无明显变化。相应的封闭实验的ELISA结果说明抗TNF一。，抗IL一lp，抗TNt了一。+抗IL一lp抗体处理组中S工以M一1，Sv以M一1的表达与单纯上清处理组相比有明显降低，但是SE一SeleCtin变化不明显;抗IL一8，抗IFN一Y的抗