目的:　　 利用血管舒张药物筛选平台,以一氧化氮信息系统为基本靶系统对38味中药进行第一次筛选,并对活性部位的舒张作用机制进行探讨。在此基础上,以内皮型一氧化氮合酶(eNOS)脱偶联为靶点进行作用机制导向的二次筛选,并探讨其作用机制,为创制改善eNOS脱偶联的新中药作出了有意的尝试和建设性的工作。　　 方法：　　 本研究首先利用离体血管环筛选平台,以舒张血管生物活性为导向,以活血化淤和清热解毒经典复方中临床应用较多的单味药为筛选对象,对三十八昧中药的五十六个提取部位进行筛选,随后利用细胞模型,以保护eNOS脱偶联生物活性为导向对舒张血管中药活性部位进行第二次筛选,在此基础上,探讨他们的舒张血管和抗eNOS脱偶联机制。本研究主要从以下几个方面进行。　　 1具有血管舒张作用中药的筛选　　 用无菌双蒸水或75％乙醇溶解中药提取物,以等比的方式从高到低设置5个浓度梯度点,最大浓度为1000μg/mL;最小浓度为0.1μg/mL,用1μmol/L去氧肾上腺素(phenylephrine,PE)预收缩血管环,待收缩平衡后逐步累积加入中药提取物溶液,最后以1μmol/L Foskolin至最大舒张并作为100％舒张,记录浓度舒张曲线,以中药血管最大舒张率超过50％为标准,进行中药筛选。　　 2中药有效部位舒张血管机制的探讨　　 2.1内皮依赖性血管舒张中药有效部位舒张血管机制探讨　　 用PE预收缩的内皮完整和去内皮的血管环检测中药部位的舒张血管活性,当加入PE血管收缩达平衡后,逐步累积加入中药部位(0.1,1,10,100,1000)mg/L,当最大浓度血管舒张达到平衡后,加入1μmol/L Foskolin至最大舒张作为100％舒张参照。　　 内皮依赖性血管舒张主要涉及到NO和PGI2合成途径,可以分别用NOS抑制剂L-NAME和环氧合酶抑制剂吲哚美辛(Indomethacin,Indo)预阻断。因此,我们用L-NAME和Indo预孵育血管,以观察对中药舒张血管作用的影响,阐明中药有效部位舒张血管涉及的信号通路。　　 2.2平滑肌依赖性血管舒张中药有效部位舒张血管机制探讨　　 平滑肌的舒张包括钾通道的激活、β受体信号通路和sGC/cGMP信号通路的激活。为了研究中药舒张血管作用机制,去内皮血管环用Kca阻断剂TEA、KIR阻断剂BaCl2、KATP阻断剂格列苯脲(glibenclamide,Glib)、β2受体阻断剂普奈洛尔(propranolol,Prop)、sGC抑制剂ODQ预处理15min,加入1μmol/L PE收缩血管,逐步积累加入中药有效部位,制作浓度依赖性舒张血管曲线。　　 2.3中药有效部位对血管收缩物质的抑制作用　　 血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)、前列腺素F2a(prostaglandin F2a,PGF2a)、血管加压素(Vasopressin,Vaso)多巴胺(Dopamine,Dopal)、五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、PE和内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)都属于血管收缩物质,在维持血管张力方面发挥重要作用,我们为了检测中药舒张血管作用是否与对这些血管收缩物质的抑制有关,用中药部位预处理血管环,观察AngⅡ、PGF2a、Vaso、Dopa、5-HT、PE和ET-1血管收缩曲线的变化。　　 2.4中药部位对钙离子内流的影响　　 去内皮血管环稳定后,换成无钙高钾K-H液(含100μmol/L EGTA和60mmol/L K+),逐步加入积累浓度CaCl2,获得钙离子收缩曲线,比较中药预处理组与对照组之间钙离子收缩曲线的变化,以60mmol/L K+最大收缩为100％对照。　　 2.5中药部位对钙离子释放的影响　　 去内皮主动脉环在K-H液中稳定后,改成无钙K-H液(含100μmol/L EGTA)平衡10min,加入1μmol/L PE后,平滑肌细胞肌浆网内钙释放而引起血管小幅度、持续缓慢收缩。药物处理组血管换成无钙K-H液孵育5min,加入中药孵育10min后,再加入1μmol/L PE,记录PE引起的血管环收缩张力变化,并比较对照组和中药处理组的张力变化。　　 3抗eNOS脱偶联筛选平台的建立　　 以AngⅡ为刺激因子,以人脐静脉内皮细胞为细胞载体,建立eNOS脱偶联细胞模型,人脐静脉内皮细胞经1μmol/L AngⅡ刺激24小时后,采用蛋白质印迹,荧光探针和HPLC检测(色谱柱:Zorbax SB-C18(150mm×4.6mm,5μm),流动相A为甲醇,B为水,A:B=5:95;流速1mL/min,柱温为35℃;荧光检测器激发波长=35nm,发射波长=450nm,时间为10min),eNOS二聚体的形成、辅助因子BH4的含量、NO生物利用度和O2-含量的变化,以考察eNOS脱偶联模型是否成功建立。　　 4抗eNOS脱偶联中药的筛选　　 利用抗eNOS脱偶联筛选平台,对舒张血管中药活性部位及其中药相关单体进行二次筛选,考察这些中药对eNOS二聚体形成、辅助因子BH4的含量和NO生物利用度和O2-含量的影响。　　 结果：　　 1桂枝乙酸乙酯部位舒张血管与抗eNOS脱偶联作用　　 1.1桂枝乙酸乙酯部位的血管舒张作用　　 桂枝乙酸乙酯部位(EFR,0.1mg/L～1000mg/L)对PE预收缩的SD大鼠离体胸主动脉环具有浓度依赖性舒张作用。内皮完整组和去内皮组血管环最大舒张效率Emax分别为89.20％±3.66％和6.59％±7.35％(P＜0.01),L-NAME对EFR诱导血管舒张的最大抑制率为89.53％(P＜0.01);ODQ的最大抑制率为72.71％(P＜0.01),L-NAME和ODQ对桂枝乙酸乙酯部位诱导的血管环舒张具有明显的阻断作用,EFR的舒张血管作用与NO/cGMP系统激活有关。　　 1.2桂枝乙酸乙酯部位的抗eNOS脱偶联作用　　 EFR(12.5μg/ML～50μg/mL)可以浓度依赖的逆转eNOS脱偶联内皮细胞形成,提高eNOS二聚体/单聚体的比值;与模型组相比,EFR高剂量(50μg/mL)NO含量上升37.0％、O2-含量下降17.23％(P＜0.01)、中剂量(25μg/mL)组NO含量上升26.0％、O2-含量下降15.5％(P＜0.01)。在12.5μg/mL～50μg/mL浓度范围内EFR可以提高eNOS脱偶联内皮细胞内的BH4含量。　　 2辛夷舒张血管与抗eNOS脱偶联作用　　 2.1辛夷二氯甲烷提取物的舒张血管作用　　 辛夷二氯甲烷提取物(CEF,0.1mg/L～1000mg/L)对PE预收缩的血管环具有浓度依赖的舒张作用,内皮去除前后最大舒张效率Emac分别为78.68％±6.03％和64.98％±13.90％,CEF诱导的舒张血管作用具有非内皮依赖性。CEF对AngⅡ、PGF2a、Dopa、Vaso、5-HT、PE和ET-1诱发的血管收缩均具有明显的抑制作用(P＜0.01),抑制率分别为91.31％、82.11％、95.32％、90.53％、72.22％、83.63％和71.56％。CEF对无钙液中PE引起的血管收缩和无钙高钾液中Ca2+收缩曲线均有显著的抑制作用(P＜0.01)。　　 2.2辛夷活性成分-木兰脂素的抗eNOS脱偶联作用　　 木兰脂素(magnolin,Mag,12.51μmol/L～50μmol/L)可以浓度依赖逆转eNOS脱偶联内皮细胞eNOS二聚体形成,提高eNOS二聚体/单聚体的比值,eNOS二聚体/单聚体的比值在Mag高剂量组(50μmol/L)和中剂量(25μmol/L)组分别比模型组高67.3％(P＜0.01)和56.6％(P＜0.01);与模型组相比,Mag高剂量(50μmol/L)组NO含量上升54.5％、O2-含量下降23.3％(P＜0.01)、中剂量(25μmol/L)组NO含量上升20.6％、O2-含量下降16.2％(P＜0.01)。在12.5μmol/L～50μmol/L浓度范围内Mag可以提高eNOS脱偶联内皮细胞内的BH4含量　　 3桑枝总生物碱的血管舒张作用　　 桑枝总生物碱(TAR,0.1mg/L～1000mg/L)对PE预收缩的血管环具有浓度依赖的舒张作用,内皮完整组和去内皮组最大舒张效率Emax分别为77.02％±28.00％和55.53％±19.17％,TAR的舒张血管作用不具有内皮依赖性。TAR对AngⅡ、Dopa、Vaso、5-HT和PE诱发的血管收缩均具有明显的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别为38.40％、47.00％、43.46％、32.11％和24.36％。　　 4甘草总黄酮的舒张作用　　 甘草总黄酮(TFR,0.1mg/L～1000mg/L)对PE预收缩的血管环具有浓度依赖的舒张作用,内皮完整组最大舒张效率Emax为91.28％±5.15％,TFR的舒张血管作用没有内皮依赖性。TFR对Dopa、AngⅡ、Vaso和ET-1诱发的血管收缩均具有明显的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别为50.71％、38.40％、33.67％、59.58％。　　 5前胡总香豆素的舒张作用　　 前胡总香豆素(TCR,0.1mg/L～1000mg/L)对PE预收缩的血管环具有浓度依赖的舒张作用,内皮去除前后最大舒张效率Emax分别为分别为75.51％±21.30％和57.07％±18.63％,TCR对血管的舒张作用没有内皮依赖性。TCR对AngⅡ、Dopa、PGF2a、5-HT、PE、Vaso和内ET-1诱发的血管收缩均具有明显的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别为86.75％、59.57％、74.55％、41.84％、64.60％、79.51％和60.55％。TCR对无钙液中PE引起的血管收缩和无钙高钾液中Ca2+收缩曲线均有显著的抑制作用(P＜0.01)。　　 6藤梨根总皂苷的舒张血管作用　　 藤梨根总皂苷(TSA)在0.1mg/L～1000mg/L的浓度范围内对PE预收缩的SD大鼠离体胸主动脉环具有浓度依赖性舒张作用。内皮完整组和去内皮组最大舒张效率Emax分别为81.66％±7.36％(P＜0.01)和5.20％±1.62％(P＜0.01),TSA的舒张血管作用具有内皮依赖性。L-NAME对TSA诱导血管舒张的最大抑制率为88.13％(P＜0.01);ODQ的最大抑制率为70.52％(P＜0.01),L-NAME和ODQ对TSA诱导血管环的舒张具有明显的阻断作用,TSA的血管舒张作用与NO/cGMP系统激活有关。　　 7鸡血藤总黄酮的舒张血管作用　　 鸡血藤总黄酮(TVS)在10mg/L～100mg/L的浓度范围内对PE预收缩内皮完整的血管脉环有浓度依赖性舒张作用。内皮完整组和去内皮组最大舒张效率Emax分别为70.70％±6.12％和7.53％±14.08％(P＜0.01),TFS的血管舒张作用具有内皮依赖性。内皮完整的管环分别用L-NAME和ODQ预处理后,加入PE引起血管收缩到达平衡后再以浓度积累的方式加入TFS舒张血管。L-NAME的最大抑制率为90.20％(P＜0.01);ODQ的最大抑制率为88.91％(P＜0.01),L-NAME和ODQ对TFS对血管环的舒张具有明显的抑制作用,TFS的舒张血管作用与NO/cGMP系统激活有关。　　 结论：　　 1.桂枝乙酸乙酯部位、鸡血藤总黄酮和藤梨根总皂苷具有内皮依赖性血管舒张作用,其机制可能与激活eNOS有关。其中,桂枝乙酸乙酯部位在一定浓度范围内还可以抑制eNOS脱偶联。　　 2.甘草总黄酮和桑枝生物碱具有非内皮依赖性血管舒张作用,具体机制未知,此外,甘草总黄酮和桑枝生物碱对部分血管收缩物质还具有抑制作用。　　 3.辛夷二氯甲烷提取物和前胡香豆素具有舒张血管作用,其机制可能与及抑制钙离子内流和胞质内钙离子释放干扰胞质内钙离子平衡有关,辛夷活性成分木兰脂素在一定浓度范围内可以抑制eNOS脱偶联。