论文部分内容阅读
Orexin是由位于外侧下丘脑区和穹隆周区的一类特定神经元产生的肽类神经递质,其神经纤维可投射至几乎整个中枢神经系统,如大脑皮层、下丘脑、边缘系统、脑干和脊髓等。Orexin前体蛋白可以裂解产生orexin-A和orexin-B,通过激活两种G蛋白偶联受体,即orexin-1型受体和orexin-2型受体,主要对下游靶区产生兴奋性调控作用并参与其介导的生理功能,如参与摄食调节、体温调节、内分泌调节、睡眠/觉醒功能及动机性行为等。因此揭示orexin神经投射参与形成的不同神经环路和各个下游靶区内orexin能信号系统发挥调节作用的神经机制对研究其在不同生理功能中的作用至关重要。鉴于orexin神经系统对觉醒相关脑区的大量投射,以往的研究更多的关注其在觉醒功能中的作用。但是也有文献指出orexin神经系统能够参与睡眠功能的调节。有研究报道,orexin神经系统能够直接投射到REM睡眠起始和维持的关键脑区蓝斑底核（sublaterodorsal tegmental nucleus,SLD）和巨细胞网状核（gigantocellular reticular nucleus,Gi）,提示orexin神经系统可能通过直接调节SLD活动和Gi神经元活动参与REM睡眠的调控。我们课题组前期免疫荧光实验证明SLD脑区确实存在orexin纤维分布和orexin受体表达。此外,离体电生理实验结果揭示SLD脑区存在广泛的电突触联系,进一步研究结果表明orexin对SLD神经元网络放电活动存在复杂的调控作用,一方面orexin通过直接的突触后效应兴奋表达orexin受体的神经元,并通过电突触将这种兴奋效应传递到更广泛的区域;另一方面orexin通过增加电突触电导增强SLD神经元之间的电突触联系,从而导致兴奋效应在整个SLD网络中的广泛同步化。因此,orexin能够整合性地影响整个SLD神经元网络的放电活动,使其更广泛、高效、协调地兴奋。然而,在体情况下,SLD中的orexin能信号系统能否发挥上述调控作用,这种调控作用对大脑功能状态和REM睡眠有何贡献目前尚不清楚。另外,我们也在Gi脑区观察到了orexin纤维分布和orexin受体表达,并且orexin能够通过激活突触后膜上的orexin-1型和orexin-2型受体在Gi神经元上引起内向电流反应。同样地,orexin引起的上述兴奋效应对Gi神经元放电活动的具体影响及机制仍未可知。综上所述,本文首先采用在体多通道记录和神经药理学技术研究SLD中的orexin能信号系统对SLD神经元网络放电活动的调控效应以及对脑功能状态的影响,然后综合采用光遗传学和化学遗传学技术探讨SLD中orexin能信号系统对REM睡眠的调控作用和机制,另一方面,采用全细胞膜片钳记录技术结合神经药理学技术研究orexin调控Gi神经元活动的电生理效应及机制。现将相关结果阐述如下:1.Orexin能信号系统调节SLD神经元网络活动及脑功能状态的在体研究（1）Orexin通过对SLD神经元网络放电活动的影响增强海马LFP振荡活动本文首先研究orexin-A对SLD脑区神经元网络放电活动的调控作用。麻醉状态下,orexin-A显著增加了记录到的69.1%（67/97）的神经元的放电频率（n=67/97 units,P<0.01）。此外,通过分析SLD神经元对在±1 ms内的同步化放电情况来评估SLD网络中电突触的活动,结果显示30μM的orexin-A使存在电突触联系的SLD神经元对比例从8.4%上升到13.0%（n=215对）,并且显著增强了88.0%的存在电突触联系的SLD神经元的同步化放电概率（n=56 units,P<0.01）。上述结果表明orexin-A能够兴奋记录到的大部分SLD神经元,并提高其兴奋时的同步化放电水平,进而导致SLD神经元网络的同步化兴奋。接下来为了进一步探究orexin对SLD神经元网络放电活动的调控效应有什么生理意义,我们采用同步记录海马局部场电位（local field potential,LFP）活动来反映SLD神经元网络的输出效率,体现脑功能状态的变化。结果发现麻醉状态下海马LFP活动呈1Hz左右的慢振荡,orexin-A增强了海马LFP慢振荡核心频段（0.3-2.5 Hz）的能量（n=5rats,P<0.05）。相位锁定分析结果显示,orexin-A显著增加了SLD神经元放电活动与海马LFP慢振荡之间的锁定强度（baseline:n=76/97 pairs,orexin:n=84/97 pairs,P<0.01）。上述结果提示orexin能信号通过引起SLD神经元网络同步化兴奋上调SLD神经元网络的输出效率,增强下游靶点海马网络活动,从而参与脑功能状态的调节。（2）Orexin引起的SLD神经元网络同步化程度的提高对调节脑功能状态至关重要为了进一步明确orexin引起的SLD神经元网络同步化兴奋与其输出效率之间的关系,我们采用CBX干扰SLD神经元网络的同步化放电水平,结果显示在CBX存在的情况下,电突触耦连SLD神经元之间的同步化放电概率减弱了47.7%（n=60 units,P<0.01）,此外,CBX完全阻断了由orexin-A引起的电突触耦连SLD神经元同步化程度的提升（n=30 units,P=0.959）,而不影响orexin-A引起的SLD神经元放电频率的增加（n=39/72 units,P<0.01）。上述结果表明CBX能够干扰SLD神经元网络的同步化程度,而不影响神经元的兴奋效应。观察此时海马LFP慢振荡发现其核心频段的能量相较于单独注射orexin-A显著降低（每组n=5 rats,P<0.05）,并且CBX完全阻断了orexin-A引起的SLD神经元放电活动与海马LFP慢振荡之间的锁定强度的增加（baseline:n=40/72,orexin+CBX:n=55/72,P=0.488）。这部分结果表明,SLD神经元网络的输出效率依赖于orexin对SLD神经元网络同步化程度的调控,一旦其同步化程度下降,将直接影响到SLD神经元网络的输出效率,从而无法实现对脑功能状态的调节。2.Orexin能信号系统对SLD调控作用的行为学效应研究（1）NREM睡眠期间激活SLD脑区的orexin能纤维末梢能够活化脑功能状态并下调肌张力,但并不引起REM睡眠的转换为了进一步研究orexin对SLD神经元网络同步化兴奋的调控引起的脑功能状态的改变对SLD介导的REM睡眠的影响,首先采用离体膜片钳记录结合光遗传学技术,结果发现激活SLD的orexin能纤维末梢在所有记录的SLD神经元上均能引起一个明显的去极化反应（n=6 neurons for each group,P<0.05）。表明光遗传学激活SLD区域的orexin能纤维末梢能够直接兴奋SLD神经元,影响SLD神经元网络的输出效率。进一步采用光遗传学方法在双侧LH注射AAV-Ef1α-DIO-ChR2-mCherry,在双侧SLD脑区埋置光纤,并同步记录EEG-EMG信号变化。在体光遗传学激活结合脑肌电记录结果显示,在小鼠进入稳定的NREM睡眠后采用不同频率的光刺激,脑电全频段能量和肌电呈刺激频率依赖性的的下降(n=6 mice,EEG:P10Hz<0.05,P20Hz<0.01,EMG:P20Hz<0.01)。光刺激频率为20 Hz时,小鼠脑电全频段能量在给光后2.4 s出现下降（n=6 mice,P<0.01）,而肌电在给光后约9 s出现下调（n=6 mice,P<0.01）,与生理情况下NREM睡眠向REM睡眠的转换类似。分析脑电功率能谱图显示,theta组分显著增加（n=6 mice,P<0.05）,但并没有引起明确而连续的theta节律,即没有转入REM睡眠。上述结果表明激活SLD的orexin能纤维末梢无法使NREM睡眠转入REM睡眠,但是确实能够激活脑功能状态,如增加theta成分占比以及引起肌张力的下调。（2）REM睡眠期间操纵SLD脑区的orexin能纤维末梢调节REM睡眠时长接下来进一步探究NREM睡眠期间的脑功能状态的激活和肌张力的下调能否贡献给生理状态的REM睡眠,我们在单次REM睡眠中光操纵SLD的orexin能纤维末梢,记录EEG-EMG信号变化和REM睡眠时长。结果显示激活SLD的orexin能纤维末梢后,theta/delta能量比增加10.5%（n=9 mice,P<0.05）,并且显著增加12.1%的平均REM睡眠时长（n=9 mice,P<0.05）。相反,抑制SLD脑区的orexin能纤维末梢减少8.0%theta/delta能量比（n=9 mice,P<0.05）,且显著减少了18.2%的平均REM睡眠时长（n=9 mice,P<0.05）,激活和抑制均未观察到显著的EMGREM/NREM改变。光遗传学结果表明SLD中的orexin能信号系统能够提升SLD神经元网络的输出效率,并通过稳定脑功能状态的激活延长单次REM睡眠时长,有助于稳定REM睡眠。（3）化学遗传学抑制SLD脑区的orexin能信号系统导致REM睡眠不稳定我们接下来研究化学遗传学抑制SLD中的orexin能信号系统对REM睡眠的影响。在双侧SLD脑区注射AAV-retro-hSyn-DIO-h M4D（Gi）-mCherry抑制SLD中的orexin能信号。与注射vehicle相比,腹腔注射CNO显著减少了17.0%的REM睡眠总量（n=8 mice,P<0.01）,而不影响觉醒时间百分比和NREM睡眠时间百分比。进一步分析发现REM睡眠总量的减少是由于平均单次REM睡眠时长减少导致的（n=8 mice,P<0.05）。另外,EMG-EEG分析结果显示,注射CNO后大部分REM睡眠片段中均出现严重且持续的肌张力迟缓障碍,并且NREM睡眠转入REM睡眠的生理性肌张力下降也被CNO阻断（n=8 mice,P<0.01）。同时,CNO注射还引起EEG活动theta/delta能量比显著减小（n=8 mice,P<0.05）。上述结果表明SLD中orexin能信号缺失会干扰脑功能状态的激活和肌张力下调,导致单次REM睡眠片段的不稳定,从而减少REM睡眠总量。3.Orexin对巨细胞网状核神经元活动的调控作用及机制研究（1）Orexin通过引起突触后去极化增强Gi神经元放电活动首先,我们在电流钳模式下研究orexin对Gi神经元放电活动的调控作用。我们发现,在电流钳模式下,Gi神经元具有自发放电,100 nM orexin-A（2 min）能够显著增强这些Gi神经元的放电活动频率（n=6 neurons,P<0.05）。此外,在灌流液中加入TTX（0.1μM）,以阻断动作电位的产生和神经元间的突触传递活动观察到orexin-A可以在Gi神经元上诱导出去极化反应（n=6 neurons,P<0.01）。上述结果提示,orexin可以通过引起突触后去极化增强Gi神经元放电活动。（2）Orexin增加Gi神经元的持续性放电能力,而不影响其输入阻抗接下来,我们进一步研究了orexin-A对Gi神经元的兴奋效应是否伴随着神经元输入阻抗的变化。通过电流输入将测试的神经元膜电位钳制于-60 mV附近,并在加入orexin-A（100 nM）诱发出去极化效应的平台期后再将其膜电位水平钳制回baseline水平。在加入orexin-A前后,分别对测试的Gi神经元施加阶梯超极化刺激（step:-10 pA,duration:2 s）。通过绘制在上述测试中得到的电流-电压曲线（current-voltage relationship）变化,可以计算得出其斜率（slope）,即为该神经元的输入阻抗。通过上述研究,我们发现,orexin对Gi神经元的输入阻抗并不存在显著影响。在这种情况下,我们进一步探讨了orexin-A对Gi神经元的放电活动模式是否存在直接的调控效应。在（2）中所述条件下,我们发现系列方波刺激（0-225 pA）可以在所有测试的Gi神经元上诱导出tonic的放电反应。有意思的是,通过绘制电流-放电频率曲线（current-frequency curve）后我们发现,orexin-A显著增强了相同电流（>100 pA）刺激在Gi神经元中所引起的放电活动频率（n=9 neurons,P<0.05）。该部分结果揭示,在相同去极化驱动力的条件下,orexin还可以直接增强Gi神经元的兴奋性。（3）Orexin通过缩短放电峰峰间距增强Gi神经元兴奋性最后,对orexin增强Gi神经元兴奋性的机制进行进一步研究。在加入orexin前后,通过分析相同电流刺激（225 pA）所诱发的放电活动的峰峰间距（inter-spike intervals）,我们发现所有测试Gi神经元的诱发动作电位的峰峰间距均在2-s刺激的后半段到达平台期。统计分析后发现,orexin对诱发放电反应的初始阶段的峰峰间距并无显著影响,有意思的是,orexin显著缩短了平台期时Gi神经元放电的峰峰间距（n=9 neurons,P<0.05）。这部分数据表明,orexin能够通过缩短放电的峰峰间距增加Gi神经元的持续性放电活动。接下来,进一步对上述缩短的峰峰间距这一现象产生的电生理基础进行了分析。我们发现orexin对Gi神经元的动作电位放电阈值、放电幅度、波形宽度均无影响。此外,orexin不影响动作电位后超极化的幅度和时间间隔。上述结果提示,orexin缩短Gi神经元放电的峰峰间距并非通过对动作电位波形的影响来实现,而是反应了自前一个动作电位后超极化的波谷水平向后一个动作电位的阈值水平更快的去极化。综上所述,本研究发现SLD中的orexin能信号能够广泛兴奋SLD神经元,并提升神经元之间的同步化放电水平,引起SLD神经元网络的同步化兴奋,从而上调SLD神经元网络的输出效率,通过增强与下游靶点海马之间的联系激活脑功能状态。在自由活动动物上,SLD中的orexin能信号系统通过稳定脑功能状态的激活稳定单次REM睡眠时长,一旦其信号缺失将会引起脑功能状态不稳定和肌张力迟缓障碍,从而导致REM睡眠不稳定。本研究揭示了orexin能信号系统调控REM睡眠的直接通路及其机制,并为理解orexin信号缺失引起的REM睡眠疾病的发病机制提供新的研究方向。另外,本研究还发现orexin能够直接调控Gi神经元的放电活动,通过增强其兴奋性促进Gi神经元持续性放电。这部分结果揭示了orexin对Gi神经元的兴奋性调控作用,为今后探索Gi脑区orexin能信号系统的生理学效应和意义以及其在Gi介导的运动行为中的具体功能奠定基础。