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研究背景光动力疗法（Photodynamic therapy,PDT）是一种近年来发展起来的治疗浅表性肿瘤的有效方法。PDT不仅能直接杀伤肿瘤,还可以诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应。PDT作用于肿瘤组织,使部分肿瘤细胞发生凋亡并且释放损伤关联模式分子（Damage-associated molecular patterns,DAMPs）,DAMPs可以被未成熟树突状细胞（Dendritic cell,DC）识别,使未成熟的DC活化为成熟的DC。成熟DC将特异性抗原呈递给T细胞从而引发对肿瘤细胞的特异性免疫杀伤。因此,DC细胞在PDT引发的抗肿瘤免疫反应中处于非常关键的位置,而DC成熟是DC发挥功能的前提。然而影响DC成熟的因素及机制目前还不十分清楚,因此研究影响PDT诱导DC成熟的因素和机制对于增强PDT引发的抗肿瘤免疫反应具有重要意义。在探讨影响PDT诱导DC成熟的因素与机制方面,蛋白4.1R是本研究关注的重点。蛋白4.1R因首先发现于红细胞并且因处于红细胞膜蛋白凝胶电泳的第4.1个条带处而得名。作为大小为80KD的膜骨架蛋白,蛋白4.1R对于维持红细胞的结构、生理功能及机械稳定性具有重要作用。虽然蛋白4.1R在红细胞中的功能研究已经比较清晰,但是在有核细胞中蛋白4.1R的作用还不十分清楚。有研究证实,蛋白4.1R通过参与有丝分裂体的形成而影响恶性肿瘤的发生和发展。我们前期研究发现与蛋白4.1R结构极为相似的蛋白4.1N参与乳腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭;另外,本课题组发现蛋白4.1R通过与转运体GAT1和GAT2相互作用影响光敏剂5-ALA的跨膜转运进而影响PDT杀伤肿瘤的效果;同时本课题组还发现蛋白4.1R通过抑制T细胞活化连接子LAT磷酸化对T细胞受体介导的信号通路发挥负调控作用而影响机体的免疫应答。鉴于前期我们发现的蛋白4.1R直接参与了免疫细胞信号活化的环节,而PDT发挥杀伤肿瘤细胞的机制之一就是通过诱导DC成熟进而使机体产生抗肿瘤免疫反应,因此我们有理由猜测蛋白4.1R可能在PDT诱导DC成熟的过程中起着重要作用进而影响PDT的免疫效应。然而关于这方面的研究目前还未见报道。研究目的本课题以野生型(4.1R+/+)和4.1R基因敲除型(4.1R-/-)DC为研究对象,探讨蛋白4.1R对PDT诱导DC成熟及抗黑色素瘤免疫的影响。本课题可以为蛋白4.1R的功能及PDT杀伤肿瘤机制的研究提供更多的理论依据。研究方法1.分别取野生型(4.1R+/+)和4.1R基因敲除型(4.1R-/-)小鼠股骨和胫骨的骨髓,体外加入含细胞因子（GM-CSF和IL-4）的1640培养基培养,诱导为4.1R+/+DC和4.1R-/-DC;利用流式细胞术检测诱导所获得两种DC的纯度;PCR和Western blot技术检测蛋白4.1R在两种DC中的表达。2.利用荧光分光光度计测量不同5-ALA孵育浓度和孵育时间条件下B16细胞内PpⅨ的积累量,确定5-ALA最佳孵育浓度和最佳孵育时间;利用FITC Annexin V凋亡试剂盒检测不同光剂量照射下B16细胞的凋亡情况,流式细胞术检测B16细胞表面的钙网蛋白的表达,ELISA法检测上清中HMGB1的分泌,确定能促使B16细胞凋亡的最佳光剂量。3.利用PDT处理过的B16细胞刺激未成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC,诱导为成熟4.1R+/+DC和4.1R-/-DC;流式检测成熟4.1R+/+DC和4.1R-/-DC表面CD80和CD86的表达情况;荧光定量PCR检测成熟4.1R+/+DC和4.1R-/-DC中IL-12p35、IFN-γ的基因表达情况;电子显微镜下观察PDT诱导成熟的两种DC形态的差异。4.利用荧光定量PCR和流式、Western blot技术检测PDT诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC膜表面相关受体的表达情况。5.PDT诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC分别活化CD8+T细胞,流式检测CD8+T细胞表面CD69的表达;CCK8法检测两种DC活化的CD8+T细胞增殖能力;LDH法检测两种DC活化的CD8+T细胞对B16黑色素瘤的杀伤效应。6.将B16-F10尾静脉注射到C57BL/6J小鼠体内建立肺转移模型。分别利用PDT诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC免疫模型小鼠。ELISA技术检测模型小鼠血清中IFN-γ和IL-12的分泌情况;统计并比较两组小鼠形成的肺转移灶;统计不同处理组小鼠的生存期制作生存曲线。研究结果1.体外诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC纯度均达到80%左右,可以用于后续实验;PCR和Western blot检测结果表明蛋白4.1R在4.1R+/+DC中表达,在4.1R-/-DC中不表达。2.B16细胞孵育4mM 5-ALA 5小时,0.25J/cm2剂量照射下,B16细胞凋亡率最高（28.45±3.04）%,且随着凋亡水平的提高,细胞表达钙网蛋白（calreticulin）的水平升高,最高达（80.73±6.09）%,上清中分泌HMGB1的量越多,最高达（7909.16±537.84）pg/mL。3.B16细胞经过PDT处理后,分别与4.1R+/+DC和4.1R-/-DC以50:1的比例共培养24小时,流式结果显示DC细胞表面CD80在4.1R+/+DC表达比例（73.70±8.13）%明显高于4.1R-/-DC（47.33±14.50）%,P﹤0.01;流式结果显示DC细胞表面CD86在4.1R+/+DC表达比例（66.00±10.64）%明显高于4.1R-/-DC（42.57±5.60）%,P﹤0.01。qRT-PCR结果表明IL-12p35在4.1R+/+DC中相对表达量（15.99±3.81）明显高于4.1R-/-DC（9.19±0.83）,P﹤0.01;IFN-γ在4.1R+/+DC中相对表达量（8.66±0.61）高于4.1R-/-DC（5.33±0.95）,P﹤0.01;透射电镜结果表明PDT诱导成熟的4.1R+/+DC比4.1R-/-DC形成的树突更丰富。上述结果表明,蛋白4.1R在DC上缺失下调PDT对DC成熟的诱导。4.PDT诱导4.1R+/+DC和4.1R-/-DC成熟过程中的第8小时,荧光定量PCR测得TLR4在4.1R+/+DC中基因表达量（3.92±0.68）显著高于4.1R-/-DC（2.97±0.34）,P﹤0.05;流式结果显示TLR4在4.1R+/+DC膜上表达量（82.33±4.58）%显著高于在4.1R-/-DC表达量（45.50±18.92）%,P﹤0.01;Western blot结果显示TLR4在4.1R+/+DC内的总表达量（1.88±0.28）显著高于在4.1R-/-DC表达量（0.61±0.14）,P﹤0.01。上述实验结果表明在PDT诱导DC成熟过程中,蛋白4.1R下调TLR4在DC中的表达。5.PDT诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC分别与4.1R+/+CD8+T和4.1R-/-CD8+T共培养（混合比例1:20,共培养时间72h）,不同的DC(4.1R+/+DC、4.1R-/-DC)刺激4.1R+/+CD8+T细胞,CD69表达情况分别为:（71.40±1.41）%vs（42.25±2.05）%P﹤0.01;不同的DC(4.1R+/+DC、4.1R-/-DC)刺激4.1R-/-CD8+T细胞,CD69表达情况分别为:（88.45±1.34）%vs（59.05±1.77）%,P﹤0.01,上述结果表明,蛋白4.1R在DC上缺失下调PDT诱导成熟的DC对CD8+T细胞的活化。6.PDT诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC分别与4.1R-/-CD8+T共培养（混合比例1:20共培养时间72h,下同）,4.1R+/+DC对4.1R+/+CD8+T的刺激指数（3.73±0.50）显著高于4.1R-/-DC对4.1R+/+CD8+T的刺激指数（1.75±0.31）,P﹤0.05;4.1R+/+DC对4.1R-/-CD8+T的刺激指数（5.23±0.33）显著高于4.1R-/-DC对4.1R-/-CD8+T的刺激指数（2.3±0.39）,P﹤0.05,上述结果表明,蛋白4.1R在DC上缺失下调PDT诱导成熟的DC介导CD8+T细胞的增殖。7.PDT诱导成熟的4.1R+/+DC和4.1R-/-DC分别与4.1R-/-CD8+T共培养（混合比例1:20共培养时间72h,下同）,在不同效靶比的条件下4.1R+/+DC-4.1R+/+CD8+T细胞对B16的杀伤能力均显著强于4.1R-/-DC-4.1R+/+CD8+T细胞,在效靶比80:1的条件下,两者的杀伤率:（47.74±3.45）%vs（24.24±2.46）%,P﹤0.001;在不同效靶比的条件下4.1R+/+DC-4.1R-/-CD8+T细胞的杀伤能力均显著强于4.1R-/-DC-4.1R-/-CD8+T细胞,在效靶比80:1的条件下,两者对的杀伤率:（60.87±2.14）%vs（36.48±2.63）%,P﹤0.001,上述结果表明,蛋白4.1R在DC上缺失下调PDT诱导成熟的DC介导CD8+T细胞对B16的杀伤。8.PDT诱导成熟的4.1R+/+DC免疫组肺转移模型小鼠血清中IFN-γ的浓度（1501±415.2）pg/ml、IL-12的浓度（88.53±26.85）pg/ml显著高于4.1R-/-DC免疫组肺转移模型小鼠IFN-γ（645.2±245.1）pg/ml、IL-12（42.57±11.12）pg/ml,P﹤0.05;PDT诱导成熟的4.1R+/+DC免疫组模型小鼠肺转移灶数量（43.40±15.08）显著少于4.1R-/-DC免疫组模型小鼠肺转移灶的数量（91.30±20.37）,P﹤0.01;PDT诱导成熟的4.1R+/+DC免疫组肺转移模型小鼠的生存期显著长于4.1R-/-DC免疫组模型小鼠,P﹤0.001。上述结果表明,蛋白4.1R在DC上缺失下调了PDT诱导成熟的DC介导的抑制黑色素瘤效果。研究结论1.蛋白4.1R参与PDT对DC成熟的诱导;蛋白4.1R缺失会导致PDT诱导DC成熟的能力下降,进而下调DC介导的CD8+T细胞的活化和增殖;2.蛋白4.1R缺失下调PDT诱导成熟的DC介导的抗黑色素瘤效果。