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本研究首先构建了 miR-144和miR-451单独敲除的小鼠模型。分析了这两种动物模型的表型改变,并与miR-144/451双敲除小鼠作比较。旨在明确miR-144/451双敲除时候的红细胞抗氧化能力下降是由miR-144单敲除引起或miR-451单敲除引起还是两者协同作用。本课题利用野生型小鼠(wt)、miR-144/451基因敲除鼠(miR-144/451-/-,mko)、miR-144 和 miR-451(miR-144-/-和 miR-451-/-,miR-144 ko 和 miR-451 ko)单敲除小鼠作为体内研究对象,通过利用wt、mko、miR-144 ko和miR-451 ko共4组不同基因型的小鼠,进行以下实验:1)检测miR-144和miR-451在外周血、骨髓红细胞中表达趋势,进一步验证miR-144和miR-451基因表达缺失后小鼠贫血现象;2)通过体内外模型阐明miR-144和miR-451功能缺失后小鼠红细胞对各种应激的反应;3)通过体内实验进一步明确mko贫血小鼠与单基因敲除小鼠外周血中超氧化剂(ROS)水平,从而进一步阐明miR-144和miR-451的抗氧化作用。通过以上实验,本研究旨在明确miR-144和miR-451功能缺失后的表型改变,以及贫血的可能分子机制。研究内容分为以下三个部分:第一部分miR-144和miR-451基因单敲除小鼠模型的建立目的:构建miR-144和miR-451缺失的小鼠模型。方法:由上海邦耀生物科技有限公司帮助构建。首先利用麻省理工学院张峰教授实验室的公用网站设计先导RNA,然后利用crispr/cas9技术敲除包括miR-144前体在内的75bp以及miR-451前体在内的72bp,构建miR-144和miR-451单敲除小鼠。由公司提供的miR-144和miR-451单敲除杂合子小鼠,通过杂合子-杂合子杂交的方法获得纯合子利用PCR方法鉴定miR-144和miR-451的杂合子和纯合子。统计子代各种基因型小鼠的存活数量是否符合孟德尔遗传定律。结果:通过PCR鉴定证实这两种单敲除小鼠的miR-144和miR-451的表达量比野生型小鼠低约4000倍,说明miR-144和miR-451缺失。经杂合子-杂合子杂交的方法所得到的总量小鼠一共572只,其中,wt小鼠147只,miR-144-/+小鼠275只,miR-144ko小鼠150只,符合孟德尔遗传定律,说明敲除miR-144和miR-451的小鼠生存正常。miR-451单敲除小鼠子代和miR-144单敲除小鼠子代结果相类似,也符合孟德尔遗传定律。结论:通过crispr/cas9技术成功敲除miR-144和miR-451单个基因,敲除miR-144和miR-451的小鼠生存正常,小鼠子代各基因型小鼠生存符合孟德尔定律。第二部分miR-144在无应激状态下的造血研究目的:明确miR-144和miR-451单敲除小鼠有无表型改变,并且将4组实验小鼠做比较,确认原miR-144/451双敲除小鼠的表型改变是由miR-144所引起还是miR-451所引起,又或是由miR-144和miR-451两者协同作用所引起。方法:通过检测6-8周龄的4组基因型小鼠(wt,miR-144ko,miR-451 ko,mko)的外周血中各种血细胞指标,明确各种小鼠贫血情况;制作外周血细胞涂片,并进行瑞氏-吉姆萨染色,明确4组小鼠外周血中红细胞形态、数量;运用流式细胞技术检测4组小鼠外周血和骨髓中的红细胞,明确红细胞的分化成熟度;检测4种小鼠脾脏的形态学及组织学变化,明确各组小鼠的代偿性造血水平。结果:1)通过全血细胞仪分析提示,miR-144ko和wt小鼠外周血参数相近,而miR-451 ko和mko小鼠外周血参数相近;2)外周血细胞涂片瑞氏-吉姆萨染色结果提示:miR-144 ko小鼠红细胞大小较均匀,与wt相同,而miR-451 ko小鼠红细胞宽度有一定程度增加,形态也与mko相似;3)流式细胞仪检测结果提示:与wt组小鼠比较,miR-451 ko组小鼠的外周血中网织红细胞比例有一定程度升高,与mko相似,而miR-144 ko与wt相似;4)脾脏形态学及组织学结果提示:与wt组小鼠比较,miR-451 ko组小鼠的脾脏一定程度增大,重量也增加,组织学结果提示脾脏中红细胞数量一定程度增加,而miR-144 ko组小鼠与wt组小鼠无异。结论:miR-144功能缺失后小鼠表型改变不明显,而miR-451功能缺失后小鼠和mko小鼠表型改变相似,提示有轻度贫血现象。因此,我们猜测原miR-144/451双敲除小鼠的表型改变可能主要是由于miR-451功能缺失所引起的。第三部分miR-144在应激状态下的造血研究目的:检测在不同应激状态下miR-144和miR-451单敲除小鼠的表型改变。方法:通过物理、化学等方法建立小鼠贫血模型,观察各类贫血小鼠精神状况,皮肤黏膜情况以及存活情况,主要模拟急性失血性贫血、急性溶血性贫血等模型从而进一步明确应激后的表型改变。1)取6-8周龄的4组基因型小鼠(wt,miR-144ko,miR-451 ko,mko)各三只,通过眼眶内眦静脉窦连续三天放血模拟急性失血性贫血小鼠模型,然后检测外周血细胞参数,明确各种小鼠贫血情况;2)取6-8周龄的4组基因型小鼠(wt,miR-144 ko,miR-451 ko,mko)各三只,通过腹腔注射一定浓度的苯肼溶液模拟急性溶血性小鼠模型,通过眼眶内眦静脉窦采取小鼠外周血检测,记录相关指标变化,检测小鼠溶血严重程度;3)取4组基因型小鼠(wt,miR-144 ko,miR-451 ko,mko)通过眼眶内眦静脉窦采血得到外周血,制成细胞悬液,DCFH-DA孵育标记后,流式细胞仪检测外周血红细胞中的ROS表达;并予以过氧化氢(H2O2)作用红细胞后检测ROS。结果:1)急性贫血性小鼠模型的小鼠都出现一过性失血过多,行动变迟缓,急性溶血小鼠模型四组小鼠都出现溶血症状,各组小鼠的皮肤和黏膜呈现苍白状况,外周血红细胞数量、血红蛋白含量、红细胞压积降低,网织红细胞比例增高,小鼠表现为溶血状态,2)急性溶血性贫血模型小鼠的外周血流式细胞仪检测结果提示:腹腔注射苯肼溶液后4组小鼠的成熟红细胞全部急剧减少,网织红细胞明显增加,检测ROS水平,miR-451 ko组与mko组的ROS水平明显高于wt组和miR-144 ko组;3)流式细胞仪检测H2O2处理后4组小鼠外周血的结果提示,与wt组小鼠比较,mko组小鼠ROS水平明显升高,miR-451 ko组ROS水平与mko趋同,miR-144 ko组与wt相似。结论:miR-451功能缺失时小鼠氧化应激能力下降,表明抗氧化能力升高,而miR-144功能缺失小鼠与wt组相似,表明其抗氧化功能不明显。本实验模拟的急性失血性贫血模型小鼠以及溶血性贫血小鼠模型为临床人类急性失血性贫血和急性溶血性贫血时应激造血提供了相关支持性。