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开口箭（Tupistra chinensis Baker）是我国传统药用植物,对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒作用,甾体皂苷是开口箭的主要活性成分,然而其甾体皂苷类化合物的抗肿瘤作用的分子机制尚不明确。研究开口箭中甾体皂苷类化合物对肿瘤细胞的凋亡以及自噬两种程序性死亡的作用,阐明其抗肿瘤作用的分子机制,对于开口箭的进一步开发具有重要意义。本实验研究旨在阐明从开口箭中分离得到的其中一个甾体皂苷类化合物5β-spirost-25（27）-en-1β,3β-diol-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-β-D-xylopyranosyl-3-O-α-L-rhamnopyranoside（SPD）抑制人肝母细胞瘤HepG2细胞和人急性髓性白血病HL-60细胞增殖的分子机制。在前期研究基础上,本研究采用人肝母细胞瘤HepG2细胞和人急性髓性白血病HL-60细胞作为研究对象,用MTT法检测SPD对细胞存活率的影响（阳性对照为顺铂）,用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,流式细胞术观察细胞周期分布变化,用JC-1染色法检测线粒体膜电位的变化,利用Western blot法分析线粒体通路上凋亡相关蛋白（PARP、caspase-3、caspase-9、Bax和Bcl-2等）的表达情况,阐明SPD诱导细胞凋亡的分子机制。另一方面,本研究运用MDC染色法初步确定细胞自噬的发生,对HepG2细胞进行GFP-LC3质粒的转染,在荧光显微镜下观察自噬标志性蛋白LC3-II的聚集从而确认自噬的发生,通过Western blot技术分析自噬相关标志性蛋白（p62、Beclin-1和LC3）的表达情况,以及自噬经典通路Akt/mTOR/p70S6K信号通路中下游关键蛋白的表达变化情况,阐明SPD诱导细胞发生自噬作用的分子机制。为进一步研究自噬与细胞凋亡、自噬与细胞死亡之间的相互关系,本研究采用自噬抑制剂Baf-A1联用SPD,利用MTT法检测细胞增殖情况;通过Western blot法检测凋亡相关主要蛋白的表达情况,阐明SPD诱导的细胞自噬在细胞凋亡以及细胞存活中的作用。实验结果表明,开口箭中的甾体皂苷SPD能显著抑制肿瘤细胞的增殖,对细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖和时间依赖性。对HL-60细胞和HepG2细胞分别作用48 h,IC50分别为2.0±0.2μM和7.4±0.1μM;阳性对照（顺铂）IC50分别为4.7±0.6μM和6.5±0.3μM,SPD对HL-60细胞表现出更显著的细胞毒作用。Annexin V-FITC/PI双染、荧光显微镜下观察HepG2细胞凋亡情况发现,随着药物浓度的增加,视野内绿色荧光和红色荧光均随之增多,直观地说明早期凋亡和晚期凋亡的HepG2细胞随药物浓度增加而逐渐增多。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,4和8μM的SPD作用于HL-60细胞,或者8和10μM的SPD作用于HepG2细胞时,能显著的提高细胞凋亡率;2μM的SPD作用于HL-60细胞和HepG2细胞,12 h即可显著提高凋亡率,36 h早期凋亡率达到最高,晚期凋亡率随作用时间增加而不断增大,72 h时达到最高,说明SPD能诱导HL-60细胞和HepG2细胞发生凋亡。流式细胞术检测细胞周期分布结果表明,SPD能阻滞HL-60细胞周期停滞在G0/G1期,能阻滞HepG2细胞周期停滞在G2/M期;JC-1染色结果进一步显示,SPD作用HL-60细胞和HepG2细胞后,线粒体膜电位显著下降,提示线粒体功能出现异常。Western blot法检测线粒体通路上的关键蛋白,发现促进细胞凋亡的蛋白Bax及PARP蛋白的剪切化形式的表达量随药物剂量的增加而增加,PARP的下游蛋白caspase-3活性形式在药物处理后也有一定程度的上调趋势,而抑制细胞凋亡的Bcl-2蛋白则在SPD作用下显著下调,提示SPD诱导HL-60细胞和HepG2细胞凋亡可能通过线粒体通路实现。综合上述结果可知,SPD能通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡发挥其细胞毒作。MDC染色和GFP-LC3质粒转染HepG2细胞,SPD能显著提高细胞中自噬小体的数量和上调LC3-II蛋白的表达,提示SPD可能诱导细胞自噬的发生;结合Western blot法检测自噬标志性蛋白（p62、Beclin-1和LC3-II）的表达,p62蛋白被下调,Beclin-1和LC3-II蛋白上调,进一步说明SPD能诱导细胞自噬的发生;通过Western blot法检测自噬经典通路Akt/mTOR/p70S6K信号通路上关键蛋白的表达,发现在SPD的作用下,mTOR蛋白磷酸化形式明显被下调,其上游的Akt蛋白和下游效应因子p70S6K和4E-BP1的磷酸化形式也被不同程度的下调,说明SPD通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导HL-60细胞和HepG2细胞自噬。为了进一步阐明SPD对细胞自噬的作用,本研究采用自噬抑制剂Baf-A1联用2μM的SPD作用于HL-60细胞,或联用8μM的SPD作用于HepG2细胞,检测SPD对细胞存活率的影响,结果发现自噬被抑制后,细胞存活率明显降低,说明SPD诱导细胞发生死亡性自噬;另一方面,检测自噬被抑制后凋亡相关蛋白的变化,发现促进细胞凋亡的相关蛋白PARP、Bax和剪切化caspase3蛋白都出现不同程度的下调,而抑制凋亡的蛋白Bcl-2受到上调,说明SPD诱导的细胞自噬促进细胞凋亡的发生。综上所述,开口箭中甾体皂苷类化合物SPD能通过线粒体途径诱导HL-60细胞和HepG2细胞凋亡、诱导细胞周期停滞并通过（PI3K）/Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导细胞自噬,共同促进HL-60细胞和HepG2细胞的凋亡和死亡。