1．引言 在器官移植发展史的早期，由于缺乏有效的抗排异药物，受者接受移植手术后常很快出现排斥反应。1963年，Starzl将硫唑嘌呤和类固醇的双联免疫抑制剂方案应用于肾移植获得成功。此后，各类免疫抑制剂的发现和应用，使器官移植工作者找到了减少排异发生的武器。但是，免疫抑制剂也是一把双刃剑；它的应用也带来了许多问题，如移植后感染的发生、长期应用免疫抑制剂的药物毒性、高额的医疗费用等等。为此，器官移植学家努力寻找更佳的保护移植物的方案；其中，“供者特异性免疫耐受”的诱导被认为是一种较好的策略，受到了较多的关注。在目前的研究状态下“部分供者特异性免疫耐受”被认为是一种现实的目标，它的概念是：“在小剂量药物维持的情况下，移植物存活，有良好的功能和组织学特性，相对正常的免疫反应，较低的感染发生率”，由此可以大大减少免疫抑制剂应用的副作用，并使移植物受者保持在一个相对良好的状态下。 自1993年Starzl提出细胞移行与嵌合体（Chimerism）是移植物被接受并长期存活的基础以来，器官移植界大多认为嵌合体与供者特异性免疫耐受有着不可分割的联系；虽然，也有不少学者持反对意见。在器官移植后，嵌合体被定义为：经过移植手术，在同一个体内存在着两套不同基因来源的细胞，即受者体内（不仅仅在移植物中）存在着供者细胞，而在移植物内则存在着受者细胞，这种供、受体之间细胞相互移行、相互存在的现象被称为嵌合现象。当供/受体细胞 硕士学位论文比例＞1％时，称为嵌合体；而＜1％时，则被称为微嵌合体 （Microchimerism，MC）。 同时，供者特异性骨髓（Donor Snednc Bone MMa『’ow，DSBM）输注作为一种有效的诱导供者特异性免疫耐受的方法，被认为与促进嵌合体的产生和维持有关。 在国内，由于缺乏高敏感性、适用性好的嵌合体检测方法和操作性良好的DSBM获取技术，限制了有关嵌合体、DSBM输注与移植免疫耐受的研究。自 1999年斗月起，浙江大学附属第一医院肾脏病中心建立了具有较强可操作性的供者椎体骨髓获取技术，率先开展肾移植后供者特异性骨髓输注的前瞻性临床对照研究，至 2000年 11月共完成40例受者的供者特异性骨髓输注。 本课题拟建立套式 PCR－SSP及 PCR－SRY两种方法，对肾移植受者外周血淋巴细胞嵌合体的存在进行检测；并通过对浙一肾脏病中心DSBM输注病例的嵌合体检测及与配对组的比较，试图了解：在国人中，按浙一肾脏病中心的模式进行DSBM输注，是否对嵌合体的产生与维持产生影响，以及不同方案DSBM输注在嵌合体产生、维持上的差异；并了解在移植物功能稳定的长期存活病例中嵌合体的检出情况。2．实验方法 根据纳人标准和排除标准，选择肾移植后联合DSBM输注病例23例 旧M组）、配对病例20例（配对组）、4年以上长期存活女性病例 16例（长期病例组）。对上述各组在相应时间点（BM及配对组：术前、术后1周、术后1月、术后2．3月、术后半年以上；长期病例组：门诊随访时）留取外周血淋巴细胞标本，分别利用本实验建立的套式 PCR－SSP（Nested PCR－Sequence Specitlc Primers）和 PCR－SRY（Sex－determination region Y）的方法，经过 DNA抽提、供受者HLAoR位点的确认、套式PCR．SSP或普通PCR扩 3 增、产物电泳、凝胶成像和分析，检测供者特异性的基因片段，以此 对嵌合体的存在与否进行定性检验。7 3．实验结果l 3．l各组间基本情况的分析l 通过卡方检验、FIShCr’S精确检验和两个独立样本的 Ko m ogorov－Smirnov 检验，比较BM 组与配对组的性别 （p－0．331）、供肾（p－0．280）和年龄（p－0．918）构成，提示无明 显差异；比较输 BMZ次与 3次组的性别（p＝l．000）、供肾 （P－l．000）和年龄（P—0．759）构成，未发现明显差异。 3．2方法敏感性和特异性的检验l 通过对模拟淋巴细胞嵌合体的检测，确认本实验采用的套式 pCR七Sp法可检测Z0．of％水平的微嵌合体，pCRSRY法可检测出 ）l％水平的嵌合体。通过设立的一系列对照的特异性检验，发现套l 式 PCR七SP法存在一定的假阳性旧M组 1例门3例，配对组 1例l／20例）。l13．3嵌合体检测结果I 用套式PCR－SSP方法检测BM组61 个标本，阳性42例 （68．9％），阴性16例（26．2％），出现杂带3 例（4．9O）被?