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研究背景:类风湿性关节炎又称类风湿(Rheumatoid arthritis,RA),是以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现的一种自身免疫性疾病。蜂毒用于治疗RA已有近千年的历史。《黄帝内经》就已有“蜂螯有毒可疗疾”的记载。蜂毒味辛、苦,性平,具有活血化瘀、消肿止痛、通经活络、祛风散寒的功效。临床和实验室资料均证实蜂毒不仅对人类RA有较好的治疗作用,对福氏佐剂、II型胶原等引起的RA动物模型也具有明显的抗炎、镇痛和保护关节软骨作用。蜂毒成分非常复杂,含有多种活性肽类。蜂毒肽占蜂毒干重的50%,可能是蜂毒主要活性成分。本次研究拟首先证实蜂毒肽治疗RA的疗效,然后再以蜂毒肽的编码基因为治疗基因,构建蜂毒肽重组AAV进行RA基因治疗研究,为进一步开发利用蜂毒肽奠定基础。第一部分:探索蜂毒肽对RA模型动物患关节的保护效果研究目的:观察蜂毒肽对RA模型动物患关节的保护效果。研究方法:雄性SD大鼠60只,随机分为蜂毒组(Bv)、蜂毒肽组(Me)、盐水对照组(Mn)和假模型组(Nn)。前三组在右后足掌部向足尖注射完全福氏佐剂诱导RA模型,之后于患侧足三里分别注射蜂毒(1mg/kg)、蜂毒肽(0.5mg/kg)、生理盐水(10ul)和生理盐水(10ul)治疗,三周后实验结束。每周测量体重一次,每周测量关节厚度一次;每3天检测缩足逃避反射时间一次。造模后7天进行Fos免疫组化检测;实验结束后拍摄正位片和侧位片观察治疗前后骨关节X光改善情况,ELISA测定关节匀浆IL-10、TNF-α含量。研究结果:各组大鼠体重都随着时间的而增加,差异都无统计学意义。注射完全福氏佐剂4天后患侧关节均出现关节肿胀,而非模型组无明显变化。观察至第12天时Me组(0.73±0.09cm)、Bv组(0.75±0.07cm)关节厚度明显低于Mn组(0.99±0.06cm),方差分析显示差异显著(P<0.05)。这一趋势一直持续至实验结束。实验开始时,各组缩足逃避反射时间在基本一致;但在造模后的第一次观察(第6天)就可以发现Me(9.5±0.5S)、Bv(10.6±0.6S)、Nn(9.8±0.8S)的缩足逃避反射时间都高于Mn组(6.3±0.6S),方差分析显示差异显著(P<0.05)。这一趋势一直持续至实验结束。Bv、Me、Mn、Nn组浅层的Fos阳性神经元的数目分别为37±6个、34±5个、56±8个、35±4个,经过方差分析显示Bv、Me、Nn组浅层的Fos阳性神经元数目差异无显著性,但与Mn组差异显著(P<0.05)。蜂毒肽及蜂毒治疗可以改善足掌关节X光表现,抑制患侧关节腔TNF-α分泌,提高患侧关节IL-10含量,方差分析显示差异显著(P<0.05)。蜂毒及蜂毒肽治疗对健侧足掌关节厚度、缩足逃避反射时间、关节细胞因子的含量均无影响。研究结论:1.通过比较蜂毒肽与蜂毒治疗RA效果的全面比较,证实蜂毒肽是蜂毒治疗RA的活性成分;2.蜂毒肽可以抑制RA关节的Th1类细胞因子的表达,增强Th2类细胞因子的表达。第二部分:蜂毒肽重组腺相关病毒及其体外鉴定研究目的:构建蜂毒肽重组腺相关病毒及其体外鉴定。实验方法:采用化学合成法合成含有26个氨基酸的蜂毒肽基因序列,其中含5‘PmacI酶切点,3’含终止子及BamHI酶切点,Klenow片段补平,连接入T载体,酶切测序鉴定。PmacI、BamHI双酶切表达盒T载体pGEM-T Easy/NT4,回收大片段,与含有Mel-cDNA序列的PmacI、BamHI双酶切产物连接,酶切鉴定后再用EcoRI与BamHI联合酶切,回收小片段,插入rAAV载体pSSCMV,与pAAV-Ad及pFG140三质粒共转染293细胞,杂交法滴定病毒滴度。体外转染HELA细胞,免疫组化测定体外蜂毒肽表达情况。实验结果:经过电泳、酶切和测序证实T载体内Mel-cDNA序列及导入的酶切位点插入正确;pGEM-T Easy/NT4与Mel-cDNA序列及其酶切位点连接正确;表达盒正确插入了rAAV载体pSSCMV;rAAV/Mel经检测滴度达到1012/ml。体外感染实验证实rAAV/Mel可以分泌表达蜂毒肽。研究结论:1.获取了蜂毒肽的基因,构建了EcoRI-NT4-NaeI-TAT-6His-PmaCI- Mel-BamHI表达盒;2.成功构建了rAAV/Mel,并可体外分泌蜂毒肽。第三部分:蜂毒肽重组腺相关病毒抗风湿作用研究研究目的:探讨蜂毒肽重组腺相关病毒的抗风湿作用。实验方法:完全弗氏佐剂诱导大鼠右后足掌关节RA模型,分别在患侧足三里给与蜂毒肽、rAAV/Mel、rAAV/GFP进行治疗;同时在患侧关节皮下、同侧臀大肌、对侧足三里注射rAAV/Mel,探讨不同注射部位对疗效的影响。定期称量体重,足掌关节厚度和缩足逃避反射时间。实验结束后拍摄正位片和侧位片观察治疗前后骨关节X光改善情况。ELISA检测关节匀浆TNF-α、IL-10含量。实验结果:注射完全福氏佐剂4天后患侧关节均出现关节肿胀,观察至第12天时Me组(0.75±0.07cm)、RMZ组(0.72±0.09cm)、RMZ(0.72±0.04cm)、RMT(0.71±0.04cm)、RMP(0.65±0.06cm),关节厚度明显低于RMD组(0.97±0.05cm)和RC组(0.94±0.04cm),方差分析显示差异显著(P<0.05),这一趋势一直持续至实验结束。各组缩足逃避反射时间在实验开始时基本一致,但在造模后的第一次观察(第6天)就发现Me组(10.4±1.1S)、RMZ组(9.7±1.5S)、RMP组(9.8±1.3S)、RMT组(9.6±0.8S)的缩足逃避反射时间都高于RMD组(6.2±1.2S),方差分析显示差异显著(P<0.05),这一趋势一直持续至实验结束。蜂毒肽及重组蜂毒肽治疗可以抑制患侧TNF-α分泌, RC、RMD组患侧关节匀浆TNF-α含量分别为270.5±23.1pg/ml、328.2±67.3pg/ml高于Me组(78.7±39.2pg/ml)、RMZ组(78.3±29.7pg/ml)、RMT组(62.3±34.5pg/ml)和RMP组(68.1±32.5pg/ml),方差分析显示差异显著(P<0.05),而对健侧关节TNF-α含量无影响。患侧足掌关节和对侧足掌关节匀浆经EILSA检测发现RC、RMD患侧关节匀浆分别为21±8.1pg/ml、24±6.3pg/ml,而Me、RMZ、RMT、RMP组IL-10含量分别为51.2±7.1pg/ml、53.4±8.0pg/ml、49.8±7.1pg/ml、48.2±7.9pg/ml,方差分析显示RC、RMD患侧关节匀浆IL-10含量低于RMZ、RMT、RMP组,差异显著(P<0.05)。提示rAAV/Mel可以促进患侧关节腔分泌IL-10,且与注射位置有关系。健侧关节匀浆IL-10含量经过方差分析检验差异无显著性。Me、RMZ、RMT、RMP组足掌关节X光表现也优于RC、RMD组。各组体重在各个时间点的差异均无统计学意义。研究结论:1.明确了基于蜂毒肽开展RA基因治疗的疗效;2.基因治疗的疗效与给药位置可能有关;3.从TNF、IL-10水平证实了rAAV/Mel治疗RA的疗效;4.通过对体重的观察研究,并未发现rAAV/Mel对模型动物有不利影响,提示了rAAV/Mel治疗RA的安全性。