【摘 要】
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目前,全球不孕症患者数目逐年攀升。辅助生殖技术（Assisted reproductive technology,ART）是治疗不孕症最有效的方法之一。玻璃化冷冻是一种在辅助生殖助孕的临床实践中广泛使用的胚胎低温保存技术。随着玻璃化冷冻技术的不断进步以及植入前产前诊断技术的发展,“全胚冷冻”策略越来越成为辅助生殖助孕中的优先选择方案。临床研究表明,冻胚移植（Frozen embryo transf
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目前,全球不孕症患者数目逐年攀升。辅助生殖技术（Assisted reproductive technology,ART）是治疗不孕症最有效的方法之一。玻璃化冷冻是一种在辅助生殖助孕的临床实践中广泛使用的胚胎低温保存技术。随着玻璃化冷冻技术的不断进步以及植入前产前诊断技术的发展,“全胚冷冻”策略越来越成为辅助生殖助孕中的优先选择方案。临床研究表明,冻胚移植（Frozen embryo transfer,FET）虽然可以改善患有多囊卵巢综合征等特定人群的妊娠结局,但仍具有较高的子痫前期和大于胎龄儿发生风险。并且当使用供卵进行辅助生殖时,与鲜胚移植（Fresh embryo transfer,fresh ET）相比,冻胚移植的胎儿存活率明显降低。这表明胚胎冷冻可能会损害胚胎发育潜能,进而影响妊娠结局。因此,对玻璃化冷冻技术可能带来的胚胎损伤、基因表达异常及子代安全性问题的探索研究具有重要意义。本研究模拟人类临床试管婴儿胚胎冷冻策略,通过对小鼠8-细胞期胚胎进行玻璃化冷冻,分析其对胚胎的整体发育的影响,并解析了氧化应激、DNA损伤、表观修饰等在玻璃化冷冻过程中的变化以及E18.5天胎儿、胎盘转录组的变化,为揭示玻璃化冷冻对胚胎发育的影响及安全性评价提供理论和实验依据。主要研究内容和结果如下:1.玻璃化冷冻对小鼠植入前及植入后胚胎发育的影响:我们对小鼠8-细胞期胚胎进行玻璃化冷冻并进行体外培养和胚胎移植,统计分析胚胎体外发育率和胚胎植入后发育率。结果发现:（1）玻璃化冷冻对小鼠体外培养胚胎的囊胚率及囊胚孵出率无显著影响,但会显著降低囊胚期细胞总数（control 60.92±2.39,vitrified49.40±1.72,p＜0.05）;（2）玻璃化冷冻会显著降低E18.5天胎儿存活率（control41.67%±4.58,vitrified 28.00%±4.07,p＜0.05）及平均窝产仔数（control 4.17±0.56,vitrified 2.80±0.4,p＜0.05）;（3）玻璃化冷冻对E18.5天胎儿和胎盘重量以及胎盘效率无显著影响。2.玻璃化冷冻影响小鼠胚胎发育的机制:为了分析玻璃化冷冻影响胚胎发育的机制,我们检测了玻璃化冷冻对囊胚期胚胎的氧化应激,DNA损伤以及表观修饰水平的影响。研究结果显示:（1）与对照组相比,玻璃化冷冻处理会导致囊胚活性氧水平增加,线粒体活性下降;（2）玻璃化冷冻会导致囊胚期细胞凋亡水平增加,DNA断裂增加;（3）抑制DNA非同源末端连接修复（Non-homologous end-joining,NHEJ）途径而不是同源重组修复（Homologous recombination,HR）途径会导致玻璃化冷冻胚胎囊胚率显著下降（control 86.06±5.11,vitrified 59.60±6.01,p＜0.05）,引起DNA断裂显著增加,囊胚细胞总数显著降低（control 60.92±2.39,vitrified 49.40±1.72,p＜0.05）;（4）玻璃化冷冻导致囊胚期H3K4me2及H4K12/16乙酰化水平升高,RNA m~6A水平降低,但对H3K9me3无显著影响。3.玻璃化冷冻对E18.5天胎儿以及胎盘RNA转录组的影响:我们收集了冷冻组及对照组E18.5天胎儿、胎盘进行RNA测序,结果发现:（1）玻璃化冷冻处理会显著影响E18.5天胎盘转录组,其中差异表达的上调基因为286个,下调基因为428个,并且上调的差异基因与细胞焦亡相关;（2）玻璃化冷冻处理会显著影响E18.5天大脑转录组,其中差异表达的上调基因为304个,下调基因为130个。
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