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磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路作为一条重要通路,在缺血性脑卒中中发挥重要作用。谷氨酸(Glu)是中枢神经系统重要的神经递质,脑缺血时会大量释放,产生兴奋性神经毒性,引起缺血性脑卒中的神经元凋亡,而星形胶质细胞膜上的谷氨酸转运体-1(GLT-1)的上调可促进对Glu的摄取,发挥神经保护作用。且一定条件下,PI3K/Akt信号通路可以调节GLT-1表达。研究表明,浅低温条件下,PI3K/Akt信号通路的激活或者GLT-1蛋白表达的增加,均能减轻脑缺血后神经元凋亡以及缺血再灌注损伤,发挥脑保护作用。但此过程中,GLT-1的上调是否受到PI3K/Akt信号通路的调控尚不清楚。因此,本课题旨在研究浅低温是否可以通过上调PI3K/Akt信号通路活性增加神经元-星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧复糖后GLT-1表达。第一部分新生SD原代大鼠神经元-星形胶质细胞共培养及氧糖剥夺/复氧复糖损伤模型的建立目的:建立神经元-星形胶质细胞共培养方法及神经元-星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)损伤模型。方法:取新生24h内SD乳鼠大脑皮层进行原代神经元-星形胶质细胞共培养。其中,星形胶质细胞用含10%FBS的DMEM/F12培养基进行培养,7d左右时进行纯化与传代,待第二代细胞铺满90%左右培养板底后,采用细胞免疫荧光法对其进行纯度鉴定。神经元培养使用Neurobasal+B27无血清培养基,待培养至7-11d左右时,采用细胞免疫荧光法对其进行纯度鉴定。神经元-星形胶质细胞共培养,将纯化后的二代星形胶质细胞传至圆爬片,待长满70%~80%后,无菌条件下移入培养至9-11d左右的神经元培养板,使用Neurobasal+B27无血清培养基共培养1-2d后进行实验。采用三气培养箱,联合无糖DMEM建立神经元-星形胶质细胞OGD/R损伤模型,氧糖剥夺4h,复氧复糖24h。通过光镜下肉眼观察、硫堇染色以及CCK-8试剂盒对OGD/R损伤模型进行评价。结果:1.新生SD原代大鼠皮层神经元多呈梭形,胞核清晰,突起间连接成网状;星形胶质细胞形态典型,多呈星状或纤维细胞样形态,胞核清晰,突起紧密连接。2.神经元纯度90%以上,星形胶质细胞纯度95%以上。3.对照(Ctrl)组神经元细胞膜光滑,结构完整,未见水肿、空洞或肿大,突起交织成网状结构;OGD/R组神经元明显肿胀,细胞结构受损,突起减少或断裂。4.Ctrl组尼氏体数量多而密集,染色深,边缘清晰;OGD/R组尼氏体均数量减少,染色变浅,边缘模糊不清。5.与Ctrl组相比,OGD/R组神经元活性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.体外培养的新生SD大鼠皮层神经元及星形胶质细胞形态典型,纯度分别为90%和95%以上,能满足进一步实验要求。2.神经元-星形胶质细胞OGD/R损伤模型造模成功。第二部分浅低温通过上调PI3K/Akt信号通路活性增加神经元-星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧复糖后GLT-1表达目的:研究浅低温(33℃)对离体神经元-星形胶质细胞共培养OGD/R后PI3K/Akt信号通路及GLT-1表达的关系。方法:依照“第一部分”方法进行原代神经元-星形胶质细胞共培养。将体外培养的细胞随机分为6组:对照(Ctrl)组、常温氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)组、浅低温氧糖剥夺/复氧复糖(HOGD/R)组、浅低温氧糖剥夺/复氧复糖+LY294002(HOGD/R+LY)组、浅低温氧糖剥夺/复氧复糖+DHK(HOGD/R+DHK)组和浅低温氧糖剥夺/复氧复糖+DMSO(HOGD/R+DM)组。三气培养箱内行氧糖剥夺4h,复氧复糖24h,浅低温处理时间与OGD/R时间一致。通过光镜下肉眼观察、硫堇染色以及CCK-8试剂盒评价各组神经元损伤程度,细胞免疫荧光法及Western Blotting观察和检测p-Akt和GLT-1蛋白的表达,谷氨酸测定试剂盒测定细胞外Glu浓度。结果:1.与Ctrl组相比,其余各组神经元活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与HOGD/R组相比,OGD/R组、HOGD/R+LY组、HOGD/R+DHK组神经元活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.与Ctrl组相比,OGD/R组细胞内绿色荧光很弱,p-Akt蛋白表达水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HOGD/R组相比,OGD/R组、HOGD/R+LY组细胞内绿色荧光很弱,p-Akt蛋白表达水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。3.与Ctrl组相比,OGD/R组细胞内红色荧光很弱,GLT-1蛋白表达水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HOGD/R组相比,OGD/R组、HOGD/R+LY组细胞内红色荧光很弱,GLT-1蛋白表达显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。4.与Ctrl组相比,其余各组Glu浓度显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与HOGD/R组相比,OGD/R组、HOGD/R+LY组、HOGD/R+DHK组Glu浓度显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.浅低温可减轻神经元-星形胶质细胞共培养氧糖剥夺/复氧复糖后神经元的损伤,发挥脑保护作用。2.浅低温脑保护的可能机制是通过激活PI3K/Akt信号通路活性而增加GLT-1蛋白表达,降低细胞外谷氨酸浓度,减轻其兴奋毒性。