前言腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是终末期肾脏病的主要替代疗法，具有血液透析(hemodialysis，HD)无法替代的优势。然而长期的腹膜透析几乎不可避免地引起腹膜炎性改变和腹膜纤维化，二者病理改变主要表现为腹膜层单核巨噬细胞浸润和腹膜细胞外基质的沉积，最终导致腹膜透析失败。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是大肠杆菌的主要致病物质，是其唯一内毒素。LPS主要来源于长期腹膜透析引起的导管相关性感染，其次肠道内细菌可穿过通透性增高的肠壁进入腹腔。LPS和腹膜透析液中的高浓度葡萄糖是引起腹膜炎性改变和腹膜纤维化的主要原因。腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cells，PMC)是腹膜表面的一层细胞，是腹膜透析时与腹膜透析液直接接触的第一道生理屏障，也是腹膜损伤反应的第一步。研究腹膜间皮细胞在LPS作用下的反应是研究腹膜损伤机制和干预腹膜损伤的基础。单核细胞趋化蛋白1(motocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是重要的趋化因子CC亚家族的一员。MCP-1的受体CCR2是一类表达于不同类型细胞(单核细胞、记忆性T淋巴细胞、嗜碱性白细胞等)上的含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体。MCP-1与CCR2结合后，CCR2变构并与G蛋白结合，激活信号转导通路，发挥生物学作用。MCP-1主要趋化单核/巨噬细胞和T淋巴细胞，诱导单核细胞、内皮细胞表达粘附分子，使各种炎性细胞尤其是单核/巨噬细胞向病变部位聚集，启动炎症反应，并促进细胞外基质的分泌，进一步导致组织器官纤维化、硬化。目前认为其在糖尿病肾病和腹膜透析腹膜炎性病变和腹膜纤维化中起到了启动和加重病变的作用。目前国内外还没有关于LPS影响PMC表达MCP-1的系统研究，因此本实验确立其为本研究课题之一。核因子kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是重要的参与炎症反应的转录因子，存在于多种组织细胞中，与多种疾病的发生和发展相关。NF-κB是调节多种因子转录的核因子，正常情况下在细胞浆中以二聚体形式与无活性的调节亚单位NF-κB抑制蛋白(inhibitory protein ofNF-κB，IκB)形成复合物，遮蔽其核定位序列。在外界多种因素刺激下，IκB在被激活的IκB激酶(IκB kinase，IKK)复合物的作用下发生磷酸化，磷酸化后的IκB被泛素识别而发生泛素化，最后被26S蛋白酶体所降解，IκB的降解使NF-κB的核定位序列暴露出来，NF-κB进入核内与相关基因启动子区κB序列结合，从而参与相关基因的转录。目前研究较多并被证明有激活转录活性的NF-κB是p65：p50二聚体，因此通常所指的NF-κB是p65：p50，参与此二聚体激活过程的主要成分有IKKβ、IκBα等。基因序列的检索和相关研究表明MCP-1的基因启动子区有NF-κB结合序列，NF-κB信号途径参与了某些组织细胞MCP-1的表达。在腹膜间皮细胞中NF-κB的表达情况是研究其是否参与了MCP-1表达过程的基础。NF-κB核移位抑制肽SN50、蛋白酶体抑制剂MG-132、IκBα磷酸化抑制剂BAY11-7082、IKKβ特异性抑制剂SC-514是NF-κB途径不同位点抑制剂，检测PMC在这些抑制剂作用下MCP-1的表达情况，可以明确NF-κB途径在LPS促进PMC表达MCP-1中的作用。研究MCP-1在PMC中的表达情况以及NF-κB途径在此过程中的作用可为改善腹膜透析失超滤提供思路。方法1、组织来源：雄性SD大鼠数只，体重120±20g，由中国医科大学动物实验中心提供。2、细胞培养：胰蛋白酶消化法分离培养PMC，倒置相差显微镜、透射电镜、扫描电镜、免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。3、在LPS、高糖作用下，用RT-PCR法检测PMC表达MCP-1mRNA的情况；用Westem blot法检测PMC表达MCP-1、p-IKKβ、IκBα、p-IκBα及细胞核内p65蛋白的情况。细胞免疫荧光法检测p65的核移位情况。细胞分组：(1)不同浓度LPS组：0、0.1、1.0、10、100mg/L；(2)1.0mg/L LPS作用不同时间组：0、0.5、1、3、12、24、48h；(3)高糖、LPS联合组：正常组、1.5％葡萄糖、1.0mg/L LPS、1.5％葡萄糖+1.0mg/L LPS。4、在SN50、MG-132、BAY11-7082、SC-514的作用下，用RT-PCR法检测MCP-1mRNA的表达情况；用Western blot法检测PMC表达MCP-1蛋白的情况。细胞分组：(1)不同浓度(10、25、50mg/L)SN50预孵育3h，加入1.0mg/L LPS再作用3h；设立SN50M(SN50无活性对照肽)对照组；(2)不同浓度(5、10、20uM)MG-132预孵育3h，加入1.0mg/L LPS再作用3h；(3)不同浓度(5、10、20uM)BAY11-7082预孵育3h，加入1.0mg/L LPS再作用3h；(4)不同浓度(10、50、100uM)SC-514预孵育1h，加入1.0mg/L LPS再作用3h。结果1、LPS促进PMC表达MCP-10.1mg/L的LPS可促进MCP-1mRNA和蛋白的表达(P<0.05)，100mg/L LPS的作用最强(P<0.01)。1.0mg/L浓度的LPS作用1h时MCP-1mRNA表达增加(P<0.05)，3h时MCP-1蛋白明显增高(P<0.05)，48h MCP-1mRNA和蛋白质表达达到最大(P<0.01)。2、高糖、LPS对PMC表达MCP-1的影响高糖促进PMC表达MCP-1(P<0.01)；与单纯高糖和单纯LPS比，高糖、LPS联合作用促进PMC表达MCP-1的作用最强(P<0.05)。3、LPS对PMC表达p-IKKβ、IκBα、p-IκBα、p65的影响在0.1mg/L LPS作用下，细胞浆中p-IKKβ增多(P<0.05)，IκBα减少，p-IκBα增多(P<0.05)，核中p65表达增加(P<0.05)，100mg/L LPS作用最大(P<0.01)；LPS作用0.5h时细胞中p-IKKβ增多(P<0.05)，IκBα减少，p-IκBα增多(P<0.05)，核中p65表达增加(P<0.01)；1h时细胞中p-IKKβ增至最多(P<0.01)，3h时细胞中p-IKKβ迅速下降，IκBα减至最低，p-IκBα增至最多(P<0.01)，细胞核中p65表达最高(P<0.01)，随后p-IKKβ缓慢下降，IκBα开始增高，p-IκBα开始减少，核中p65表达开始下降，24h时p-IKKβ、p-IκBα再次增高，IκBα减少，p65在核内明显增多，48h时p-IKKβ、p-IκBα显著下降，IκBα明显增高，p65在核内明显减少。4、NFκB信号途径在LPS促进PMC表达MCP-1中的作用与LPS组比，10mg/L SN50、5uM MG-132、5uM BAY11-7082、10uM SC-514均可抑制LPS作用下MCP-1mRNA和蛋白质的表达(P<0.05)，50mg/L SN50、20uMMG-132、20uM BAY11-7082、100uM SC-514明显抑制MCP-1mRNA和蛋白质的表达(P<0.01)；SN50M则无此作用(P>0.05)。结论1、LPS促进PMC表达MCP-1mRNA和蛋白质呈浓度和时间依赖性；2、高浓度葡萄糖和LPS联合作用对PMC表达MCP-1mRNA和蛋白质的作用大于单纯葡萄糖或单纯LPS；3、LPS可浓度依赖性促使PMC中p-IKKβ表达增多；IκBα减少、p-IκBα增多；p65发生核移位；IKKβ-IκBα-p65活性呈双峰表现；4、LPS促进PMC表达MCP-1是IKKβ—IκBα—p65：p50信号途径依赖的。